本技術(shù)涉及生物合成，尤其是涉及一種吡啶酮類化合物及其生物合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、吡啶酮（pyridinone）類化合物是一種重要的有機化合物，其分子結(jié)構(gòu)上含有比較獨特的六元芳環(huán)（吡啶環(huán)）和酮基團，其吡啶環(huán)中同時含有羰基和n雜原子。根據(jù)氮原子與羰基相對位置的不同，分為2-吡啶酮，3-吡啶酮和4-吡啶酮。目前，化學(xué)合成的吡啶酮類化合物為單羰基吡啶酮為主，可作為有機化合物合成的關(guān)鍵原料或中間體，在制備抗生素、藥物和染料領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

2、2-吡啶酮和4-吡啶酮廣泛存在于各種天然產(chǎn)物中，據(jù)報道其衍生物具有抗菌、消炎、抗腫瘤以及殺蟲等生物活性。由于吡啶酮結(jié)構(gòu)特征和相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)，該結(jié)構(gòu)已成為合成抗生素和藥物的重要骨架。

3、專利申請?zhí)枮?02180007672.3的中國專利公開了一種可作為mat2a抑制劑吡啶酮化合物；吡啶酮本身易被空氣氧化，但3-位有取代基時則相對穩(wěn)定，其衍生物在染料行業(yè)中可作為綠黃光到橙色偶氮染料的偶合組分，其具有偶合能力強，合成的染料消光系數(shù)高，色光鮮艷，耐曬牢度高等優(yōu)異特性，廣泛應(yīng)用于分散、活性染料合成。新吡啶酮類化合物的發(fā)現(xiàn)對開發(fā)新型抗生素、藥物和染料具有重要的意義。

4、微生物中存在的非核糖體肽合成酶（nonribosomal?peptide?synthetase，nrps）的產(chǎn)物是多種抗生素和天然色素的來源，包括最小霉素（minimycin）和觀藍(lán)（indigoidine）。最小霉素和觀藍(lán)具有類似的結(jié)構(gòu)單體，中國專利cn?110777155?b中推測一種吡啶酮類化合物為它們共同的前體，但未能獲得該化合物明確的結(jié)構(gòu)特征。zhang等人(zhang?z,?li?p,?wang?m,?et?al.?(s)‐3‐aminopiperidine‐2,?6‐dione?is?abiosynthetic?intermediate?of?microbial?blue?pigment?indigoidine[j].?mlife,2022,?1(2):?146-155.)提出(s)-3-氨基哌啶-2.6二酮為觀藍(lán)的合成中間體之一，并通過構(gòu)建非核糖體肽合成酶突變體，實現(xiàn)了以谷氨酰胺為底物合成哌啶酮類化合物，但未涉及吡啶酮類化合物的生物合成。

5、目前，吡啶酮類化合物的制備仍然以化學(xué)合成方法為主，生物合成吡啶酮類化合物的方法未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種吡啶酮類化合物及其生物合成方法和應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本技術(shù)采取的技術(shù)方案為：

3、本技術(shù)提供了一種吡啶酮類化合物，所述吡啶酮類化合物的分子式為c5h4n2o3，相對分子量為140.0；

4、所述吡啶酮類化合物的化學(xué)名稱為5-氨基吡啶-2,3,6-三酮或5-羥基-3-亞氨基吡啶-2,6-二酮；

5、所述5-氨基吡啶-2,3,6-三酮的化學(xué)式如式（i）所示：

6、

7、式（i）；

8、所述5-羥基-3-亞氨基吡啶-2,6-二酮的化學(xué)式如式（ii）所示：

9、

10、式（ii）。

11、本技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了并獲得該吡啶酮類化合物，并確定其化學(xué)分子式為c5h4n2o3，命名為5-氨基吡啶-2,3,6-三酮或5-羥基-3-亞氨基吡啶-2,6-二酮。該吡啶酮類化合物有作為原料或中間體應(yīng)用于新型抗生素、藥物和染料制備的潛力。

12、本技術(shù)還提供了一種編碼所述的吡啶酮類化合物的吡啶酮合成酶編碼基因，所述吡啶酮合成酶編碼基因包括吡啶酮合成酶編碼基因pds1、吡啶酮合成酶編碼基因pds2和吡啶酮合成酶編碼基因pds3；

13、所述吡啶酮合成酶編碼基因pds1、吡啶酮合成酶編碼基因pds2和吡啶酮合成酶編碼基因pds3分別由觀藍(lán)合成酶編碼基因bpsa、觀藍(lán)合成酶編碼基因indc和觀藍(lán)合成酶編碼基因idgs的觀藍(lán)合成酶氧化結(jié)構(gòu)域催化位點的堿性氨基酸突變?yōu)橹行园被針?gòu)成。

14、本技術(shù)在針對現(xiàn)有觀藍(lán)合成酶（一種非核糖體肽合成酶）結(jié)構(gòu)研究過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，觀藍(lán)合成酶bpsa、觀藍(lán)合成酶indc和觀藍(lán)合成酶idgs的觀藍(lán)合成酶氧化結(jié)構(gòu)域（oxidation?domain）催化位點且為堿性氨基酸，將其突變?yōu)橹行园被幔瑫茐挠^藍(lán)合成酶氧化結(jié)構(gòu)域的催化能力，改變了酶的催化活性，進(jìn)而抑制觀藍(lán)的合成，會促進(jìn)其前體-一種吡啶酮類化合物的積累，從而使觀藍(lán)合成酶轉(zhuǎn)化為吡啶酮合成酶pds1、pds2和pds3，實現(xiàn)了以谷氨酰胺為底物合成5-氨基吡啶-2,3,6-三酮或5-羥基-3-亞氨基吡啶-2,6-二酮。

15、作為本技術(shù)所述編碼所述的吡啶酮類化合物的吡啶酮合成酶編碼基因的優(yōu)選實施方式，所述觀藍(lán)合成酶氧化結(jié)構(gòu)域催化位點包括觀藍(lán)合成酶氧化結(jié)構(gòu)域的第876位點。

16、作為本技術(shù)所述編碼所述的吡啶酮類化合物的吡啶酮合成酶編碼基因的優(yōu)選實施方式，所述堿性氨基酸包括組氨酸，所述中性氨基酸包括丙氨酸。

17、在本技術(shù)的技術(shù)方案中，觀藍(lán)合成酶bpsa、觀藍(lán)合成酶indc和觀藍(lán)合成酶idgs的第876位點均位于觀藍(lán)合成酶的氧化結(jié)構(gòu)域的催化口袋，且都為堿性氨基酸，將該位點的堿性氨基酸組氨酸定向突變?yōu)橹行缘谋彼岷螅瑫茐难趸Y(jié)構(gòu)域的催化能力，進(jìn)而抑制觀藍(lán)的合成，促進(jìn)前體-吡啶酮類化合物的積累，從而使觀藍(lán)合成酶轉(zhuǎn)化為吡啶酮合成酶。

18、基于上述氨基酸位點的突變，觀藍(lán)合成酶bpsa的觀藍(lán)合成酶氧化結(jié)構(gòu)域第876位點的堿性氨基酸組氨酸定向突變?yōu)橹行缘谋彼幔纬捎^藍(lán)合成酶突變體bpsa-h876a命名吡啶酮合成酶編碼基因pds1（pyridinone?synthetase?1）；

19、觀藍(lán)合成酶indc的觀藍(lán)合成酶氧化結(jié)構(gòu)域第876位點的堿性氨基酸組氨酸定向突變?yōu)橹行缘谋彼幔纬捎^藍(lán)合成酶突變體indc-h876a，命名吡啶酮合成酶編碼基因pds2（pyridinone?synthetase?2）；

20、觀藍(lán)合成酶idgs的觀藍(lán)合成酶氧化結(jié)構(gòu)域第876位點的堿性氨基酸組氨酸定向突變?yōu)橹行缘谋彼幔^藍(lán)合成酶突變體idgs-h876a，命名吡啶酮合成酶編碼基因pds3（pyridinone?synthetase?2）。

21、作為本技術(shù)所述編碼所述的吡啶酮類化合物的吡啶酮合成酶編碼基因的優(yōu)選實施方式，所述吡啶酮合成酶編碼基因pds1的核苷酸序列如seq?id?no：1所示；所述吡啶酮合成酶編碼基因pds2的核苷酸序列如seq?id?no：2所示；所述吡啶酮合成酶編碼基因pds3的核苷酸序列如seq?id?no：3所示。

22、本技術(shù)還提供了含有所述的吡啶酮類化合物的吡啶酮合成酶編碼基因的載體或重組載體。

23、本技術(shù)還提供了一種生物合成所述的吡啶酮類化合物的代謝工程菌的構(gòu)建方法，所述代謝工程菌的構(gòu)建方法包括以下步驟：

24、向宿主菌導(dǎo)入吡啶酮合成酶編碼基因pds1、吡啶酮合成酶編碼基因pds2和吡啶酮合成酶編碼基因pds3中的至少一種與磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因構(gòu)建得到代謝工程菌；

25、所述代謝工程菌生物合成所述的吡啶酮類化合物；

26、所述吡啶酮合成酶編碼基因pds1、吡啶酮合成酶編碼基因pds2和吡啶酮合成酶編碼基因pds3分別由觀藍(lán)合成酶編碼基因bpsa、觀藍(lán)合成酶編碼基因indc和觀藍(lán)合成酶編碼基因idgs的觀藍(lán)合成酶氧化結(jié)構(gòu)域催化位點的堿性氨基酸突變?yōu)橹行园被針?gòu)成。

27、觀藍(lán)合成酶編碼基因bpsa編碼觀藍(lán)合成酶bpsa；觀藍(lán)合成酶編碼基因indc編碼觀藍(lán)合成酶indc；觀藍(lán)合成酶編碼基因idgs編碼觀藍(lán)合成酶idgs。

28、作為本技術(shù)所述代謝工程菌的構(gòu)建方法的優(yōu)選實施方式，所述磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因包括磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因entd、indb和sfp中的至少一種。

29、作為本技術(shù)所述代謝工程菌的構(gòu)建方法的優(yōu)選實施方式，所述磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因entd的核苷酸序列如seq?id?no：4所示；所述磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因indb的核苷酸序列如seq?id?no：5所示；所述磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因sfp的核苷酸序列如seq?id?no：6所示。

30、作為本技術(shù)所述代謝工程菌的構(gòu)建方法的優(yōu)選實施方式，所述宿主菌包括大腸桿菌及其衍生菌株、谷氨酸棒狀桿菌及其衍生菌株、鏈霉菌及其衍生菌株和酵母菌及其衍生菌株中的至少一種。

31、優(yōu)選地，所述宿主菌包括大腸桿菌（escherichiacoli）或谷氨酸棒狀桿菌（corynebacterium?glutamicum）。

32、優(yōu)選地，所述大腸桿菌（escherichia?coli）包括但不限于大腸桿菌bl21(de3)；所述谷氨酸棒狀桿菌（corynebacterium?glutamicum）包括但不限于谷氨酸棒狀桿菌atcc13032。

33、本技術(shù)采用的宿主菌包括但不限于大腸桿菌，谷氨酸棒桿菌，鏈霉菌和酵母菌等常見的微生物。

34、經(jīng)過實驗可知，原始的大腸桿菌bl21(de3)、谷氨酸棒狀桿菌atcc?13032均不能利用葡萄糖、甘油、谷氨酸或谷氨酰胺合成5-氨基吡啶-2,3,6-三酮或5-羥基-3-亞氨基吡啶-2,6-二酮，需要在大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中導(dǎo)入相關(guān)酶基因至代謝工程菌中，才能實現(xiàn)5-氨基吡啶-2,3,6-三酮或5-羥基-3-亞氨基吡啶-2,6-二酮的生物合成。

35、所述代謝工程菌株包括但不限于由吡啶酮合成酶pds1、pds2和pds3中任意一種或多種與磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶entd、indb和sfp中任意一種或多種，搭配組合后在不同宿主菌構(gòu)建的具有類似吡啶酮合成能力的代謝工程菌株。

36、作為本技術(shù)所述代謝工程菌的構(gòu)建方法的優(yōu)選實施方式，所述構(gòu)建方法包括以下任意一種：

37、將重組載體擴增，然后將吡啶酮合成酶編碼基因pds1和重組載體連接，進(jìn)行pcr擴增，獲得重組載體i，再將磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因entd和重組載體i連接，獲得重組載體ii，將所述重組載體ii導(dǎo)入大腸桿菌中得到代謝工程菌；

38、或者，將重組載體擴增，然后將吡啶酮合成酶編碼基因pds2和重組載體連接，進(jìn)行pcr擴增，獲得重組載體i，再將磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因indb和重組載體i連接，獲得重組載體ii，將所述重組載體ii導(dǎo)入大腸桿菌中得到代謝工程菌；

39、或者，將重組載體擴增，然后將吡啶酮合成酶編碼基因pds3和重組載體連接，進(jìn)行pcr擴增，獲得重組載體i，再將磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因sfp和重組載體i連接，獲得重組載體ii，將所述重組載體ii導(dǎo)入大腸桿菌中得到代謝工程菌；

40、或者，將重組載體擴增，然后將吡啶酮合成酶編碼基因pds1和重組載體連接，進(jìn)行pcr擴增，獲得重組載體i，再將磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因entd和重組載體i連接，獲得重組載體ii，將所述重組載體ii導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌中得到代謝工程菌；

41、或者，將重組載體擴增，然后將吡啶酮合成酶編碼基因pds2和重組載體連接，進(jìn)行pcr擴增，獲得重組載體i，再將磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因indb和重組載體i連接，獲得重組載體ii，將所述重組載體ii導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌中得到代謝工程菌；

42、或者，將重組載體擴增，然后將吡啶酮合成酶編碼基因pds3和重組載體連接，進(jìn)行pcr擴增，獲得重組載體i，再將磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因sfp和重組載體i連接，獲得重組載體ii，將所述重組載體ii導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌中得到代謝工程菌；

43、所述重組載體i包括但不限于重組載體pcdfduet-pds1、重組載體pcdfduet-pds2、重組載體pcdfduet-pds3、重組載體pxmj19-pds1、重組載體pxmj19-pds2和重組載體pxmj19-pds3中任意一種重組載體；

44、所述重組載體ii包括但不限于重組載體pcdfduet-pds1-entd、重組載體pcdfduet-pds2-indb、重組載體pcdfduet-pds3-sfp、重組載體pxmj19-pds1-entd、重組載體pxmj19-pds2-indb、重組載體pxmj19-pds3-sfp中任意一種。

45、作為本技術(shù)所述代謝工程菌的構(gòu)建方法的優(yōu)選實施方式，所述pcr擴增采用核苷酸序列如seq?id?no：7~20所示的引物擴增。

46、優(yōu)選地，所述重組載體包括pcdfduet重組載體和pxmj19重組載體中的至少一種。

47、本技術(shù)還提供了上述代謝工程菌的構(gòu)建方法獲得的代謝工程菌。

48、在一些具體實施例中，所述代謝工程菌包括大腸桿菌（e.?coli）重組菌株hg-n-pd01、hg-n-pd02、hg-n-pd03，谷氨酸棒狀桿菌（c.?glutamicum）hg-n-pd04、hg-n-pd05、hg-n-pd06。

49、在一些具體實施例中，所述代謝工程菌為大腸桿菌重組菌株hg-n-pd01，所述大腸桿菌重組菌株hg-n-pd01由重組載體pcdfduet-pds1-entd導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)構(gòu)建而得。

50、所述重組載體pcdfduet-pds1-entd是由吡啶酮合成酶編碼基因pds1及來源于c.glutamicum的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因entd分別經(jīng)過pcr擴增、基因合成、連接至重組載體pcdfduet-1獲得。

51、所述吡啶酮合成酶編碼基因pds1，為觀藍(lán)合成酶定點突變體bpsa-h876a的基因序列，通過定點突變引物進(jìn)行pcr擴增獲得。

52、所述重組載體pcdfduet-pds1-entd的構(gòu)建方法，具體步驟如下：

53、（1）吡啶酮合成酶編碼基因pds1，由觀藍(lán)合成酶編碼基因bpsa定點突變pcr擴增獲得，磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因entd通過基因合成獲得。

54、（2）使用無縫克隆試劑盒依次將pds1、entd基因片段插入pcdfduet-1載體兩個多克隆位點，得到重組載體pcdfduet-pds1-entd。

55、（3）使用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將pcdfduet-pds1-entd轉(zhuǎn)至大腸桿菌bl21(de3)，得到大腸桿菌重組菌株hg-n-pd01（即重組大腸桿菌bl21?(de3)/pcdfduet-bpsa-entd）。重組大腸桿菌bl21?(de3)/pcdfduet-bpsa-entd來源于中國專利為cn?118184576?a。

56、在一些具體實施例中，所述代謝工程菌為大腸桿菌重組菌株hg-n-pd02，所述大腸桿菌重組菌株hg-n-pd02由重組載體pcdfduet-pds2-indb導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)構(gòu)建而得。

57、所述重組載體pcdfduet-pds2-indb是由吡啶酮合成酶編碼基因pds2及來源于s.chromofuscus的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因indb分別經(jīng)過pcr擴增、基因合成、連接至重組載體pcdfduet-1獲得。

58、所述吡啶酮合成酶編碼基因pds2，為觀藍(lán)合成酶定點突變體indc-h876a的基因序列，通過定點突變引物進(jìn)行pcr擴增獲得。

59、在一些具體實施例中，所述代謝工程菌為大腸桿菌重組菌株hg-n-pd03，所述大腸桿菌重組菌株hg-n-pd03由重組載體pcdfduet-pds3-sfp導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)構(gòu)建而得。

60、所述重組載體pcdfduet-pds3-sfp是由吡啶酮合成酶編碼基因pds3及來源于b.subtilis的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因sfp分別經(jīng)過pcr擴增、基因合成、連接至重組載體pcdfduet-1獲得。

61、所述吡啶酮合成酶編碼基因pds3，為觀藍(lán)合成酶定點突變體idgs-h876a的基因序列，通過定點突變引物進(jìn)行pcr擴增獲得。

62、在一些具體實施例中，所述代謝工程菌是谷氨酸棒狀桿菌（c.?glutamicum）重組菌株hg-n-pd04。

63、其中，所述谷氨酸棒狀桿菌（c.?glutamicum）重組菌株hg-n-pd04是由重組載體pxmj19-pds1-entd導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌atcc13032構(gòu)建而得。

64、所述重組載體pxmj19-pds1-entd是由吡啶酮合成酶編碼基因pds1及來源于c.glutamicum的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因entd分別經(jīng)過pcr擴增、基因合成、連接至重組載體pxmj19獲得。

65、所述重組載體pxmj19-pds1-entd的構(gòu)建方法，具體步驟如下：

66、（1）吡啶酮合成酶編碼基因pds1，由觀藍(lán)合成酶編碼基因bpsa定點突變pcr擴增獲得，磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因entd通過基因合成獲得。

67、（2）使用無縫克隆試劑盒將pds1、entd基因片段插入pxmj19載體多克隆位點，得到重組載體pxmj19-pds1-entd。

68、（3）利用電轉(zhuǎn)法將重組載體pxmj19-pds1-entd轉(zhuǎn)入谷氨酸棒狀桿菌atcc13032中，得到谷氨酸棒狀桿菌（c.?glutamicum）重組菌株hg-n-pd04。

69、在一些具體實施例中，所述代謝工程菌為谷氨酸棒狀桿菌重組菌株hg-n-pd05，所述谷氨酸棒狀桿菌（c.?glutamicum）重組菌株hg-n-pd05是由重組載體pxmj19-pds2-indb導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌atcc?13032構(gòu)建而得。

70、所述重組載體pxmj19-pds2-indb是由吡啶酮合成酶編碼基因pds2及來源于s.chromofuscus的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因indb分別經(jīng)過pcr擴增、基因合成、連接至重組載體pxmj19獲得。

71、所述吡啶酮合成酶編碼基因pds2，由觀藍(lán)合成酶編碼基因indc定點突變pcr擴增獲得。

72、在一些具體實施例中，所述代謝工程菌為谷氨酸棒狀桿菌重組菌株hg-n-pd06，所述谷氨酸棒狀桿菌（c.?glutamicum）重組菌株hg-n-pd06是由重組載體pxmj19-pds3-sfp導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌atcc?13032構(gòu)建而得。

73、所述重組載體pxmj19-pds3-sfp是由吡啶酮合成酶編碼基因pds3及來源于b.subtilis的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因sfp分別經(jīng)過pcr擴增、基因合成、連接至重組載體pxmj19獲得。

74、所述吡啶酮合成酶編碼基因pds3，由觀藍(lán)合成酶編碼基因idgs定點突變pcr擴增獲得。

75、本技術(shù)構(gòu)建的大腸桿菌（e.?coli）重組菌株hg-n-pd01、hg-n-pd02、hg-n-pd03、谷氨酸棒狀桿菌（c.?glutamicum）重組菌株hg-n-pd04、hg-n-pd05、hg-n-pd06通過載體高效表達(dá)吡啶酮合成酶、4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，均實現(xiàn)5-氨基吡啶-2,3,6-三酮或5-羥基-3-亞氨基吡啶-2,6-二酮的合成。

76、本技術(shù)還提供了上述代謝工程菌在生物合成吡啶酮類化合物中的應(yīng)用。

77、本技術(shù)還提供了一種所述的吡啶酮類化合物的生物合成方法，所述生物合成方法利用所述的代謝工程菌表達(dá)吡啶酮合成酶，催化谷氨酰胺生物合成天然吡啶利酮類化合物。

78、本技術(shù)還提供了一種所述的代謝工程菌的發(fā)酵液或提取物，所述發(fā)酵液或提取物包括所述的吡啶酮類化合物。

79、本技術(shù)還提供了一種發(fā)酵所述的吡啶酮類化合物的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量濃度的組分：

80、葡萄糖30-50?g/l，甘油5-10g/l，糖蜜5-10?g/l，玉米漿5-10?g/l，十二水合磷酸氫二鉀2-5?g/l，磷酸二氫鉀2-5g/l，硫酸銨20-30?g/l，七水硫酸鎂0.5-1.5?g/l，七水硫酸亞鐵0.05-0.1g/l，溶劑為水。

81、優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的初始ph為6.5。

82、優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量濃度的組分：葡萄糖40?g/l，甘油7g/l，糖蜜7g/l，玉米漿干粉8g/l，十二水合磷酸氫二鉀3g/l，磷酸二氫鉀3.5?g/l，硫酸銨25g/l，七水硫酸鎂0.8?g/l，七水硫酸亞鐵0.07g/l，溶劑為水。

83、本技術(shù)的代謝工程菌可以用于發(fā)酵生產(chǎn)，在培養(yǎng)基中可以發(fā)酵合成吡啶酮類化合物。

84、培養(yǎng)基中碳源使用葡萄糖和甘油，混合碳源提高了菌株的三羧酸循環(huán)效率，增強了吡啶酮的前體谷氨酸和谷氨酰胺的合成；玉米漿和糖蜜在提供菌株生長必要的有機氮源的，同時補充了部分微量元素和生長因子，保證了工程菌前期的正常生長；十二水合磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀作為緩沖對維持發(fā)酵ph穩(wěn)定；七水硫酸亞鐵抑制谷氨酰胺降解酶活性，增加吡啶酮前體積累；七水硫酸鎂提供關(guān)鍵酶輔因子，保持其催化活性。

85、在一些具體實施例中，本技術(shù)提供的含有吡啶酮類化合物的發(fā)酵液由大腸桿菌（e.?coli）重組菌株hg-n-pd01發(fā)酵獲得，其發(fā)酵液的制備方法具體的步驟如下：挑取重組菌株hg-n-pd01單菌落轉(zhuǎn)接至5?ml?lb培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有50μg/ml鏈霉素，37℃，220rpm培養(yǎng)16h，以1％接種量接種至裝有50ml?pds發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入終濃度為50μg/ml鏈霉素以及終濃度為0?.1mm的誘導(dǎo)劑iptg，繼續(xù)培養(yǎng)至48h后，獲得含有吡啶酮類化合物的發(fā)酵液。

86、在一些具體實施例中，本技術(shù)提供的含有吡啶酮類化合物的發(fā)酵液由谷氨酸棒狀桿菌（c.?glutamicum）重組菌株hg-n-pd04發(fā)酵獲得，其發(fā)酵液的制備方法具體的步驟如下：挑取重組菌株hg-n-pd04單菌落轉(zhuǎn)接至5?ml?bhisg培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有15μg/ml氯霉素和50μg/l生物素，30℃，220rpm培養(yǎng)16h，以1％接種量接種至50ml?pds發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入終濃度為15μg/ml氯霉素和50μg/l生物素，32℃，220rpm，培養(yǎng)6h后加入終濃度為1mm?iptg，繼續(xù)培養(yǎng)至48h后，獲得含有吡啶酮類化合物的發(fā)酵液。

87、本技術(shù)還提供了上述吡啶酮類化合物在制備新型抗生素、藥物或染料中的應(yīng)用。

88、本技術(shù)利用基因工程技術(shù)，分別改造大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的代謝路徑并表達(dá)非核糖體多肽合成酶，實現(xiàn)了以葡萄糖為底物發(fā)酵合成吡啶酮類化合物或其烯醇式互變異構(gòu)體。所述吡啶酮類化合物是從大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌發(fā)酵液中首次分離獲得的，并通過質(zhì)譜、核磁等分析手段推斷出了分子結(jié)構(gòu)。

89、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)具有以下有益效果：

90、本技術(shù)提供了一種吡啶酮類化合物及其生物合成方法和應(yīng)用，本技術(shù)基于合成生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，通過改造非核糖體肽合成酶（觀藍(lán)合成酶），在多種宿主內(nèi)異源表達(dá)非核糖體肽合成酶突變體，首次發(fā)現(xiàn)了并獲得該吡啶酮類化合物，并確定其化學(xué)分子式為c5h4n2o3，命名為5-氨基吡啶-2,3,6-三酮或5-羥基-3-亞氨基吡啶-2,6-二酮，該新型吡啶酮類化合物，可作為原料或中間體應(yīng)用于新型抗生素、藥物和染料的開發(fā)與制備。