本申請屬于微生物，尤其是涉及一種預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法。

背景技術(shù)：

1、鼠傷寒沙門氏菌（salmonella?typhimurium）是一種革蘭氏陰性桿菌，屬于腸桿菌科沙門氏菌屬，廣泛存在于自然界中，是一種腸道致病菌，可引起人畜共患疾病，其中雛鴨感染后死亡率可達30-80?%，主要表現(xiàn)為精神萎靡、腹瀉（黃綠色稀糞）、呼吸困難、神經(jīng)癥狀、死亡，給養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展造成巨大危害。

2、鼠傷寒沙門氏菌的抗原構(gòu)成非常復雜，其外膜蛋白、o抗原、h抗原、多糖等具有良好的免疫原性，均可用于其藥物開發(fā)的候選免疫原；益生菌在發(fā)酵過程中分泌多種胞外多糖、脂肽、多肽、蛋白等，具有多種免疫學功能，從其發(fā)酵液中篩選鼠傷寒沙門氏菌的免疫類似物可為該病的藥物開發(fā)提供重要價值；目前篩選獲得的抗病原菌（毒）功能性益生菌多是代謝物中含有直接抗病毒、抗菌物質(zhì)，對于動物的保護期短，需要多次用藥才能達到持續(xù)有效的效果；普通篩選方法需要先采集樣本，對樣本進行處理后再篩選，步驟繁瑣費時；且目前的篩選方法一次只能篩選一種或者幾種菌，檢測效率低。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本申請實施的目的在于提供一種預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的鼠傷寒沙門氏菌篩選效率低，步驟繁瑣、成功率低的技術(shù)問題，可從大量益生菌中快速高效的篩選到鼠傷寒沙門氏菌免疫類似物，利用該免疫類似物制備的藥物可長效的預防鴨鼠傷寒沙門氏菌病發(fā)生。

2、為實現(xiàn)上述目的，本申請采用的技術(shù)方案是：提供一種預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，具體包括以下步驟：

3、（一）、候選益生菌活化和培養(yǎng)：將候選益生菌接入液體培養(yǎng)基中活化，得到候選益生菌培養(yǎng)液；將候選益生菌培養(yǎng)液離心，收集上清得到候選益生菌測試液；

4、（二）、功能性益生菌高通量篩選：將候選益生菌測試液進行兩倍梯度稀釋，分別吸取不同稀釋倍數(shù)的候選益生菌測試液、鼠傷寒沙門氏菌標準抗原、生理鹽水，滴于清潔玻璃板上；隨后滴加鼠傷寒沙門氏菌陽性血清，使鼠傷寒沙門氏菌陽性血清與玻璃板上的液體均勻混合，涂布成液面，不斷輕輕搖動玻璃板，觀察結(jié)果；梯度稀釋的稀釋倍數(shù)在21-210之間，具體稀釋倍數(shù)根據(jù)實驗結(jié)果進行調(diào)整，不局限在21-210之間。

5、（三）、功能性益生菌篩選：當鼠傷寒沙門氏菌標準抗原發(fā)生凝集、生理鹽水不凝集時，篩選出與鼠傷寒沙門氏菌陽性血清形成凝集的候選益生菌測試液相對應的益生菌，即為篩選出的功能性益生菌。

6、在其中一實施例中，

7、候選益生菌為嗜酸乳桿菌。

8、在其中一實施例中，

9、液體培養(yǎng)基為mrs液體培養(yǎng)基。

10、在其中一實施例中，

11、步驟（一）活化的條件為：37?℃恒溫培養(yǎng)18?h。

12、在其中一實施例中，

13、步驟（一）離心的轉(zhuǎn)速為8000?r/min，離心時間為10?min。

14、在其中一實施例中，

15、步驟（二）候選益生菌測試液稀釋用到的稀釋液為滅菌生理鹽水。

16、在其中一實施例中，

17、候選益生菌測試液、鼠傷寒沙門氏菌標準抗原、生理鹽水和鼠傷寒沙門氏菌陽性血清的吸取量均為30?μl。

18、在其中一實施例中，

19、步驟（二）液面的直徑為1-2?cm。

20、在其中一實施例中，

21、步驟（二）涂布成液面后，2?min后觀察結(jié)果。

22、在其中一實施例中，

23、篩選方法還包括雛鴨免疫攻毒試驗。

24、有益技術(shù)效果：本申請?zhí)峁┝艘环N預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，是一種基于平板凝集試驗的高通量反向篩選方法，可快速、高效地篩選出可分泌鼠傷寒沙門氏菌免疫類似物的功能性益生菌，極大地提高了篩選效率和降低篩選成本，篩選得到的功能性益生菌能夠預防鼠傷寒沙門氏菌感染，安全無毒、無副反應發(fā)生，且免疫持續(xù)期長，具有重要的臨床應用價值；功能性益生菌可以制備成功能性益生菌疫苗或口服產(chǎn)品，有效預防臨床養(yǎng)殖中鼠傷寒沙門氏菌的感染，顯著降低鴨死亡率，提高經(jīng)濟效益。

技術(shù)特征：

1.預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，其特征在于，所述候選益生菌為嗜酸乳桿菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基為mrs液體培養(yǎng)基。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，其特征在于，步驟（一）所述活化的條件為：37?℃恒溫培養(yǎng)18?h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，其特征在于，步驟（一）所述離心的轉(zhuǎn)速為8000?r/min，離心時間為10?min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，其特征在于，步驟（二）所述候選益生菌測試液稀釋用到的稀釋液為滅菌生理鹽水。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，其特征在于，所述候選益生菌測試液、鼠傷寒沙門氏菌標準抗原、生理鹽水和鼠傷寒沙門氏菌陽性血清的吸取量均為30?μl。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，其特征在于，步驟（二）所述液面的直徑為1-2?cm。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，其特征在于，步驟（二）涂布成液面后，2?min后觀察結(jié)果。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，其特征在于，篩選方法還包括雛鴨免疫攻毒試驗。

技術(shù)總結(jié)
本申請公開了一種預防鼠傷寒沙門氏菌的功能性益生菌高通量反向篩選方法，其屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，該方法是一種基于平板凝集試驗的高通量反向篩選方法，可快速、高效地篩選出可分泌鼠傷寒沙門氏菌免疫類似物的功能性益生菌，極大地提高了篩選效率和降低篩選成本，篩選得到的功能性益生菌能夠預防鼠傷寒沙門氏菌感染，安全無毒、無副反應發(fā)生，且免疫持續(xù)期長，具有重要的臨床應用價值；功能性益生菌可以制備成功能性益生菌疫苗或口服產(chǎn)品，有效預防臨床養(yǎng)殖中鼠傷寒沙門氏菌的感染，顯著降低鴨死亡率，提高經(jīng)濟效益。

技術(shù)研發(fā)人員：辛瑞祥,曹陽,魯愛玲,王輝,王宏華,張勇,孫偉,趙光勛,徐婷婷
受保護的技術(shù)使用者：濰坊華卓生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28