本發明涉及醫學領域，尤其是免疫療法。本發明提供了多功能分子，該多功能分子包含與結合部分共價連接的單個抗cd28結合結構域，該結合部分與在免疫細胞表面上特異表達的靶標結合。

背景技術：

1、t細胞識別并殺傷其細胞靶點的能力取決于一組協調的相互作用。這些指令的主要示例是t細胞受體(tcr)復合物識別和結合靶細胞。其他相互作用例如cd28可進一步促進t細胞激活。t細胞在其表面呈遞cd28，它可以提供共刺激信號以經由tcr復合物增強激活。當t細胞經由其tcr復合物識別其靶細胞，然后又經由與其靶細胞結合的cd28參與共刺激信號時，t細胞激活被增強。

2、激動型抗cd28?mab可用于培養的t細胞的持續的離體擴增。然而，在全身性測試超級激動型抗cd28?mab的i期臨床試驗中，由于一系列急性和嚴重的不良事件，不鼓勵使用針對cd28的抗體(hgnig,?nature?reviews?immunology.2012;?12:317-318)。局部或靶向使用抗cd28?mab可用于促進抗腫瘤免疫，具有較低的風險(jung?et?al.,?int?jcancer.2001?jan?15;91?(2):225-30)。

3、因此，需要開發靶向人cd28的安全免疫療法的改良的藥劑，特別是用于治療癌癥。

4、現有技術中研究的療法核心是減少非特異性靶向，更具體地說是通過制備針對cd28和腫瘤特異性抗原(如pd-l1)的雙特異性抗體。它可與cd28的共刺激作用結合并阻斷pd-1/pd-l1的腫瘤靶向檢查點抑制作用，以實現腫瘤的直接靶向。此類抗體的示例可以在wo2022/094299和wo2022/081886中找到。

技術實現思路

0、發明概述

1、發明人首次提供了多功能分子，其能夠在一側結合cd28，并且在另一側結合人t細胞上特異表達的另一個靶標，尤其是pd-1。令人驚訝的是，盡管將cd28激動劑和另一種t細胞特異性抗原結合結構域進行組合，這種多功能分子不會引起預期的問題，即使根據先前使用抗cd28超級激動劑的試驗結果這種組合初看起來會被認為是有害的。

2、此外，這種多功能分子展示了順式靶向和順式激活能力。事實上，它通過兩個結合結構域與單個t細胞結合，從而對t細胞產生有效但可控的刺激，而沒有任何形式的過度刺激的風險。

3、此外，盡管它缺乏腫瘤特異性結合能力，但它能夠靶向位于腫瘤內或腫瘤附近的t細胞，從而避免對腫瘤沒有任何特異性的t細胞的全身性激活。

4、本發明的分子尤其適用于預防和/或治療多種疾病，特別是癌癥。

5、相應地，發明人提供了用于多種治療應用，特別是用于治療癌癥的多功能分子，其包含與結合部分共價連接的單個抗cd28結合結構域，該結合部分與在t細胞表面上特異表達的靶標結合。

6、本發明的多功能分子能夠與t細胞順式結合。這種順式靶向能力特異性激活表達cd28和另一種t特異性抗原(如pd-1)的t細胞，并且不激活幼稚的非特異性t細胞，從而避免了非特異性激活并且限制了本發明的分子的毒性。

7、另外，本發明的多功能分子不表現出反式激活，即，共同靶向腫瘤細胞和t細胞，避免了潛在的不期望的副作用。

8、因此，本發明的多功能分子實現了提供有效治療多種病癥(包括癌癥)，但具有很小的副作用或沒有副作用的多功能分子的目標。

9、在第一方面，本發明涉及多功能分子，該分子包含以下或基本上由以下組成：

10、(a)第一結合部分，所述第一結合部分與在t細胞表面上特異表達的靶標結合，該靶標選自由pd-1、vista、ctla-4、btla、tigit、cd160、lag3和tim3組成的組；以及

11、(b)第二結合部分，所述第二結合部分對cd28具有激動作用并且是抗cd28抗原結合結構域，所述抗cd28抗原結合結構域包含重鏈可變結構域(vh)和輕鏈可變結構域(vl)以及任選地重鏈恒定結構域(ch1)和輕鏈恒定結構域(cl)，其中：

12、(i)重鏈可變結構域(vh)包含互補決定區(cdr)?hcdr1、hcdr2和hcdr3，并且

13、(ii)輕鏈可變結構域(vl)包含互補決定區(cdr)?lcdr1、lcdr2和lcdr3，

14、其中：

15、-?重鏈cdr1?(hcdr1)包含seq?id?no:?30的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合；

16、-?重鏈cdr2?(hcdr2)包含seq?id?no:?31的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合；

17、-?重鏈cdr3?(hcdr3)包含seq?id?no:?32的氨基酸序列或由其組成；任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合；

18、-?輕鏈cdr1?(lcdr1)包含seq?id?no:?33的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合；

19、-?輕鏈cdr2?(lcdr2)包含seq?id?no:?34的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合；并且

20、-?輕鏈cdr3?(lcdr3)包含seq?id?no:?35的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合；

21、其中所述多功能分子包含單個抗cd28抗原結合結構域。

22、優選地，在t細胞表面上特異表達的靶標是pd-1。

23、在一些實施方案中，第一結合部分是第一抗原結合結構域，其包含vh和vl以及任選地輕鏈恒定結構域(cl)和重鏈恒定結構域(ch1)，并且其中所述第一抗原結合結構域與第一fc鏈的n末端連接，并且該分子進一步包含與第一fc鏈形成fc結構域的第二fc鏈。

24、優選地，抗cd28抗原結合包含vh和vl，以及任選地cl和ch1，優選包含：

25、(i)包含hcdr1、hcdr2和hcdr3的重鏈可變結構域(vh)，以及

26、(ii)包含lcdr1、lcdr2和lcdr3的輕鏈可變結構域(vl)，

27、其中：

28、-?重鏈cdr1?(hcdr1)包含seq?id?no:?30的氨基酸序列或由其組成；

29、-?重鏈cdr2?(hcdr2)包含seq?id?no:?31的氨基酸序列或由其組成；

30、-?重鏈cdr3?(hcdr3)包含seq?id?no:?32的氨基酸序列或由其組成；

31、-?輕鏈cdr1?(lcdr1)包含seq?id?no:?33的氨基酸序列或由其組成；

32、-?輕鏈cdr2?(lcdr2)包含seq?id?no:?34的氨基酸序列或由其組成，

33、-?輕鏈cdr3?(lcdr3)包含seq?id?no:?35的氨基酸序列或由其組成；

34、甚至更優選地包含(a)vh，其包含seq?id?no:?44的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合；以及(b)vl，其包含seq?id?no:?45的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該飾選自取代、添加、缺失及其任意組合。

35、特別地，抗cd28抗原結合結構域與以下共價連接：(i)第一結合部分的cl的c末端，(ii)第一結合部分的ch1的c末端，(iii)第一結合部分的vh的n末端，或(iii)第一結合部分的vl的n末端，任選地通過肽接頭。

36、在一些實施方案中，該分子包含共同形成fc結構域的第一fc鏈和第二fc鏈，并且抗cd28抗原結合結構域與fc鏈之一的c末端共價連接，優選在其n末端與第一抗原結合結構域共價連接的第一fc鏈，任選地通過肽接頭。

37、在一些實施方案中，該分子包含共同形成fc結構域的第一fc鏈和第二fc鏈，抗cd28抗原結合結構域通過其c末端與第二fc鏈的n末端共價連接，并且第一抗原結合結構域通過其c端與第一fc鏈的n末端共價連接，任選地通過肽接頭。

38、優選地，抗cd28抗原結合結構域是fab、crossmab或scfv，優選scfv。

39、特別地，在根據本發明的多功能分子中：

40、-?抗cd28抗原結合結構域是scfv，從n末端至c末端，vh與vl連接，優選通過肽接頭；或

41、-?抗cd28抗原結合結構域是scfv，從n末端至c末端，vl與vh連接，優選通過肽接頭。

42、在一些實施方案中，抗cd28抗原結合結構域是fab或crossmab。

43、特別地，在抗cd28抗原結合結構域中，(i)重鏈可變結構域(vh)進一步包含重鏈可變區框架區(hfr)?hfr1、hfr2、hfr3和hfr4，它們分別包含seq?id?no:?36、37、38和39的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合，并且

44、(ii)輕鏈可變結構域(vl)進一步包含區框架區(lfr)?lfr1、lfr2、lfr3和lfr4，它們分別包含seq?id?no:?40、41、42和43的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合。

45、更特別地，抗cd28抗原結合結構域包含：(a)重鏈可變區(vh)，其包含選自由seqid?no:?44、83、84、85和88組成的組的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個氨基酸修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合，優選取代；以及(b)輕鏈可變區(vl)，其包含選自由seq?id?no:?45、86、87、89和90組成的組的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個氨基酸修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合，優選取代。

46、優選地，抗cd28抗原結合結構域包含：(a)vh，其包含seq?id?no:?44的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合，優選在框架區中；以及(b)vl，其包含seq?id?no:?45的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合，優選在框架區中。

47、在一些實施方案中，在本發明的多功能分子中，第一結合部分是或來自選自下組的抗pd-1抗體：帕博利珠單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、匹地利珠單抗(pidilizumab)、西米普利單抗(cemiplimab)、卡瑞利珠單抗(camrelizumab)、aunp12、amp-224、agen-2034、替雷利珠單抗(tisleizumab)、pdr001、mk-3477、pf-06801591、jnj-63723283、杰諾單抗(genolimzumab)、lzm-009、bcd-100、shr-1201、bat-1306、ak-103、medi-0680、js001、bi-754091、cbt-501、incshr1210、tsr-042、gls-010、am-0001、sti-1110、mga012或ibi308，優選帕博利珠單抗或納武單抗。

48、在一些實施方案中，第一結合部分是抗pd-1抗原結合結構域，優選包含：

49、(i)包含hcdr1、hcdr2和hcdr3的vh，以及(ii)包含lcdr1、lcdr2和lcdr3的vl，

50、其中：

51、-?重鏈cdr1?(hcdr1)包含seq?id?no:?1的氨基酸序列或由其組成；

52、-?重鏈cdr2?(hcdr2)包含seq?id?no:?2的氨基酸序列或由其組成；

53、-?重鏈cdr3?(hcdr3)包含seq?id?no:?3的氨基酸序列或由其組成；

54、-?輕鏈cdr1?(lcdr1)包含seq?id?no:?4的氨基酸序列或由其組成；

55、-?輕鏈cdr2?(lcdr2)包含seq?id?no:?5的氨基酸序列或由其組成，和

56、-?輕鏈cdr3?(lcdr3)包含seq?id?no:?6的氨基酸序列或由其組成，

57、優選地其中所述抗pd-1抗原結合結構域是f(ab’)2、fab或crossmab。

58、優選地，第一結合部分是抗-pd-1抗原結合結構域，優選包含：(a)vh，其包含seqid?no:?15的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合；優選在框架區中；以及(b)vl，其包含seq?id?no:?16的氨基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾，該修飾選自取代、添加、缺失及其任意組合，優選在框架區中。

59、優選地，抗pd-1抗原結合結構域是f(ab’)2、fab或crossmab。

60、在一些實施方案中，第一結合部分是抗pd-1抗原結合結構域，其包含：

61、a)(i)包含hcdr1、hcdr2和hcdr3的vh，和(ii)包含lcdr1、lcdr2和lcdr3的vl，其中：重鏈cdr1?(hcdr1)包含seq?id?no:?65的氨基酸序列或由其組成；重鏈cdr2?(hcdr2)包含seq?id?no:?66的氨基酸序列或由其組成；重鏈cdr3?(hcdr3)包含seq?id?no:?67的氨基酸序列或由其組成；輕鏈cdr1?(lcdr1)包含seq?id?no:?68的氨基酸序列或由其組成；輕鏈cdr2?(lcdr2)包含seq?id?no:?69的氨基酸序列或由其組成，以及輕鏈cdr3?(lcdr3)包含seq?id?no:?70的氨基酸序列或由其組成；或

62、b)i)包含seq?id?no:?71的氨基酸序列或由其組成的vh；和ii)包含seq?id?no:72的氨基酸序列或由其組成的vl；或

63、c)(i)包含hcdr1、hcdr2和hcdr3的vh，和(ii)包含lcdr1、lcdr2和lcdr3的vl，其中：重鏈cdr1?(hcdr1)包含seq?id?no:?73的氨基酸序列或由其組成；重鏈cdr2?(hcdr2)包含seq?id?no:?74的氨基酸序列或由其組成；重鏈cdr3?(hcdr3)包含seq?id?no:?75的氨基酸序列或由其組成；輕鏈cdr1?(lcdr1)包含seq?id?no:?76的氨基酸序列或由其組成；輕鏈cdr2?(lcdr2)包含seq?id?no:?77的氨基酸序列或由其組成，以及輕鏈cdr3?(lcdr3)包含seq?id?no:?78的氨基酸序列或由其組成；或

64、d)i)包含seq?id?no:?79的氨基酸序列或由其組成的vh；和ii)包含seq?id?no:80的氨基酸序列或由其組成的vl。

65、在第二方面，本發明涉及編碼根據本發明的多功能分子的分離的核酸序列或分離的核酸序列組，或包含所述分離的核酸序列或分離的核酸序列組的載體。

66、在第三方面，本發明涉及宿主細胞，其包含本發明的載體或分離的核酸或分離的核酸分子組。

67、在第四方面，本發明涉及產生根據本發明的多功能分子的方法，包括培養根據本發明的宿主細胞的步驟和分離多功能分子的步驟。

68、在第五方面，本發明涉及藥物組合物，其包含根據本發明的多功能分子、根據本發明的核酸或核酸分子組或根據本發明的載體或根據本發明的宿主細胞以及藥學上可接受的載劑。

69、特別地，根據本發明的藥物組合物、多功能分子、核酸、核酸分子組、載體、宿主細胞用作藥物。

70、特別地，根據本發明的藥物組合物、多功能分子、核酸、核酸分子組、載體、宿主細胞，其用于治療癌癥或治療感染性疾病。

71、優選地，疾病是選自下組的癌癥：腦癌、癌、宮頸癌、結直腸癌、食道癌、胃癌、胃腸道癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、膠質瘤、間皮瘤、黑色素瘤、胃癌、尿道癌、環境誘發的癌癥以及所述癌癥的任意組合。

72、或者，疾病是由選自下組的病毒引起的感染性疾病：人免疫缺陷病毒、肝炎病毒、皰疹病毒、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、人嗜t淋巴細胞病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、jc病毒和蟲媒病毒性腦炎病毒。

73、在一些實施方案中，根據本發明的藥物組合物、多功能分子、核酸或核酸分子組、載體或宿主細胞，其用于與放療或與另外的治療劑，特別是化療劑或抗感染劑組合使用。

74、特別地，另外的治療劑選自下組：化療劑、抗感染劑、烷化劑、血管生成抑制劑、抗體、抗代謝物、抗有絲分裂劑、抗增殖劑、抗病毒劑、極光激酶抑制劑、細胞凋亡促進劑、死亡受體通路激活劑、bcr-abl激酶抑制劑、雙特異性t細胞銜接器抗體藥物綴合物、布魯頓酪氨酸激酶(btk)抑制劑、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑、細胞周期抑制劑、環氧化酶-2抑制劑、白血病病毒癌基因同源物受體抑制劑、生長因子抑制劑、熱休克蛋白-90抑制劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑、激素療法、細胞凋亡蛋白抑制劑、抗生素、激酶抑制劑、驅動蛋白抑制劑、jak2抑制劑、哺乳動物雷帕霉素靶標抑制劑、microrna、絲裂原激活的細胞外信號調節激酶抑制劑、多價結合蛋白、非甾體抗炎藥、聚adp核糖聚合酶抑制劑、鉑類化療劑、polo樣激酶抑制劑、磷酸肌醇-3激酶抑制劑、蛋白酶體抑制劑、嘌呤類似物、嘧啶類似物、受體酪氨酸激酶抑制劑、維a酸類、小抑制性核糖核酸(sirna)、拓撲異構酶抑制劑、泛素連接酶抑制劑、低甲基化劑、檢查點抑制劑、肽疫苗、癌癥疫苗、來自腫瘤抗原的表位或新表位，以及這些藥劑中一種或多種的組合。

75、最后，本發明涉及用于治療有此需要的受試者的疾病例如癌癥或感染性疾病的方法，包括施用本發明的多功能分子或藥物組合物，優選以有效量施用。

76、本發明還涉及根據本發明的多功能分子或藥物組合物在制備用于治療疾病例如癌癥或感染性疾病的藥物中的用途。