本發(fā)明涉及水凝膠-細(xì)胞組合物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、已發(fā)現(xiàn)包含細(xì)胞培養(yǎng)物的三維(3d)系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，例如用于研究腫瘤行為的細(xì)胞球狀體和用于基于細(xì)胞的移植療法的細(xì)胞包封。有前景的細(xì)胞包封材料包括水凝膠、具有可調(diào)性質(zhì)的柔軟和濕潤(rùn)的生物材料，因它們模擬原生細(xì)胞外基質(zhì)(即水環(huán)境)，具有出色的傳質(zhì)特性，并顯示出類似組織的彈性。這些特性允許細(xì)胞生長(zhǎng)并保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境危害，從而在較長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)保持細(xì)胞活性。

2、本領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)報(bào)道了用于細(xì)胞包封的各種類別的水凝膠。已知的水凝膠通常包含動(dòng)物或植物來(lái)源的蛋白質(zhì)，如明膠或谷蛋白。然而，所有這些材料都顯示出相對(duì)低的機(jī)械柔性，因此不能用于加工。已知的水凝膠還可能包含對(duì)某些類型的細(xì)胞有毒的物質(zhì)。因此，這種水凝膠不能用于基于細(xì)胞的應(yīng)用。

3、已經(jīng)開(kāi)發(fā)了包含纖維素材料(例如，纖維素納米纖維、纖維素納米晶體、羧甲基纖維素)的水凝膠用于細(xì)胞包封。用于生產(chǎn)此類水凝膠的已知方法通常涉及初始纖維素溶解以形成纖維素微凝膠，其隨后用于細(xì)胞包封。

4、例如，serizawa等人(acs?macro?lett.2020,9,301-305)描述了中和誘導(dǎo)的纖維素低聚物自組裝成結(jié)晶納米帶網(wǎng)絡(luò)以生產(chǎn)用于3d細(xì)胞培養(yǎng)的物理交聯(lián)的水凝膠。

5、另一實(shí)例公開(kāi)于ep4053141中。其中描述了一種用于懸浮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基組合物，其包含纖維素低聚物。例如，可以將培養(yǎng)基組合物添加到hela細(xì)胞中。

6、組合物中的纖維素低聚物不會(huì)凝固并使細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)。

7、在jp2017201895中公開(kāi)了另一個(gè)實(shí)例，其涉及具有明膠的合成纖維素三維結(jié)構(gòu)。動(dòng)物細(xì)胞可以添加到該結(jié)構(gòu)中并在其表面生長(zhǎng)。

8、并且，jp2018145216描述了一種人工合成的纖維素三維結(jié)構(gòu)，其用作動(dòng)物細(xì)胞的支架。

9、ep0928795記載了一種天然有機(jī)聚合物的制備方法，這種聚合物用作制備水凝膠的凝膠化劑。

10、然而，這些方法復(fù)雜且效率極低。此外，為了獲得所需的理化性質(zhì)，纖維素材料必須進(jìn)行改性或與其它材料組合。用于交聯(lián)纖維素的化學(xué)方法涉及有毒的化學(xué)交聯(lián)劑和催化劑，例如2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基(2,2,6,6-tertramethylpiperdine-1-oxylradicals)。這些有毒化學(xué)物質(zhì)對(duì)被這種纖維素材料包封的細(xì)胞的生存能力產(chǎn)生負(fù)面影響。

11、迄今為止，本領(lǐng)域已知的水凝膠的缺點(diǎn)阻礙了穩(wěn)定的水凝膠-細(xì)胞組合物的開(kāi)發(fā)。因此，本發(fā)明的目的是提供克服現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的手段和方法，以生產(chǎn)穩(wěn)定且可生物相容的水凝膠-細(xì)胞組合物，該組合物例如可用于組織工程和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，如生物打印等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、因此，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)穩(wěn)定的水凝膠-細(xì)胞組合物的方法，其包括以下步驟：

2、a)提供反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包括至少一種可聚合底物和至少一種能夠聚合所述至少一種底物的酶以及細(xì)胞，和

3、b)孵育步驟a)的混合物以形成穩(wěn)定的水凝膠-細(xì)胞組合物。

4、令人驚訝的是，結(jié)果證明如果水凝膠在細(xì)胞存在下酶促合成，則細(xì)胞可以在水凝膠中穩(wěn)定下來(lái)。本發(fā)明的方法是由可聚合底物自下而上合成的方法，所述可聚合底物在與至少一種聚合酶和細(xì)胞混合后能夠形成聚合物網(wǎng)絡(luò)。因此，本發(fā)明的水凝膠-細(xì)胞組合物的聚合物網(wǎng)絡(luò)是在細(xì)胞存在下，通過(guò)至少一種可聚合底物的酶促聚合來(lái)構(gòu)建的。與包含水凝膠與細(xì)胞簡(jiǎn)單接觸的步驟的方法相比，本發(fā)明的合成水凝膠的自下而上策略使得包埋入水凝膠的細(xì)胞穩(wěn)定更長(zhǎng)的時(shí)期。

5、本發(fā)明的方法允許在整個(gè)過(guò)程中進(jìn)一步形成具有優(yōu)異生物相容性的機(jī)械穩(wěn)定的水凝膠。由于酶反應(yīng)造成原位凝膠化，細(xì)胞可以被包埋/包封在水凝膠內(nèi)，更均勻和更有效地成形。如前所述，這種包埋/包封方法顯著延長(zhǎng)了水凝膠內(nèi)包含的細(xì)胞的活力。

6、使用可聚合底物和酶來(lái)形成水凝膠也是有利的，因?yàn)檫@樣可以產(chǎn)生可生物相容的水凝膠基質(zhì)，其有利于包埋/包封在水凝膠中的細(xì)胞和本發(fā)明水凝膠-細(xì)胞組合物的潛在醫(yī)學(xué)用途。

7、因此，本發(fā)明的制備水凝膠的方法鑒于以下完全適用于細(xì)胞包埋/包封：a)通過(guò)將細(xì)胞預(yù)混合在水性反應(yīng)溶液中，從而由于原位凝膠化和包封獲得細(xì)胞在水凝膠內(nèi)的均勻分布，b)用于凝膠合成的溫和條件，其在包封期間保持細(xì)胞活力，和c)水凝膠組合物中使用的可生物相容的和生態(tài)友好的材料，使得此系統(tǒng)適用于基于人和動(dòng)物的應(yīng)用。此外，本發(fā)明的方法是一種快速、簡(jiǎn)單和劃算的方法，不需要專門(mén)設(shè)備，并使不具有專業(yè)知識(shí)或?qū)嶒?yàn)室設(shè)備的人能夠使用該技術(shù)(例如在預(yù)先配制好的試劑盒中)。

8、可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的水凝膠也可用于組織工程。其中，水凝膠承擔(dān)了細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械任務(wù)以及其他任務(wù)。當(dāng)生長(zhǎng)中的細(xì)胞分泌其自身的細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)，不溶于水的部分可被酶促分解。由于降解過(guò)程必須是可控的，例如纖維素纖維特別適用于細(xì)胞，優(yōu)選缺乏自身纖維素酶的真核細(xì)胞。

9、本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)穩(wěn)定的水凝膠組合物的方法，其包括以下步驟：

10、a)提供反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包括至少一種可聚合底物和至少一種能夠聚合所述至少一種底物的酶和黃原膠，和

11、b)孵育步驟a)的混合物以形成穩(wěn)定的水凝膠組合物。

12、事實(shí)證明，本發(fā)明方法中使用的向反應(yīng)混合物中添加黃原膠導(dǎo)致合成穩(wěn)定的水凝膠，該水凝膠與包含其它添加的聚合物(例如基于多糖的聚合物)的水凝膠組合物相比，具有優(yōu)異的機(jī)械性能。此外，已經(jīng)證明，與其他水凝膠相比，特別是與包括其他聚合物(例如，其他多糖)的水凝膠相比，通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的水凝膠在更長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)保持其機(jī)械性能。將黃原膠添加到由本發(fā)明的方法生產(chǎn)的水凝膠中，使所述水凝膠具有進(jìn)一步的機(jī)械穩(wěn)定性。水凝膠組合的這種增強(qiáng)的機(jī)械穩(wěn)定性顯著增加了該組合的使用范圍。包含黃原膠的水凝膠的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其可生物相容性，與其他添加劑相比，其允許更有效地穩(wěn)定包埋/包封在其中的生物分子(例如，酶)或細(xì)胞。與不含黃原膠的水凝膠相比，這使得產(chǎn)品具有更長(zhǎng)的保質(zhì)期，因?yàn)樵谒鏊z組合中，生物和酶活性保留更長(zhǎng)的時(shí)間段。

13、本發(fā)明的另一方面涉及可以通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的或通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的水凝膠-細(xì)胞組合物。

14、本發(fā)明的另一方面涉及乳酸乳球菌(lactococcus?lactis)菌株10123，其于2022年2月4日保藏在dsmz，保藏號(hào)為dsm?34156。

15、乳酸乳球菌菌株10123對(duì)葡萄球菌屬(staphylococcus)的各種細(xì)菌物種顯示出令人驚訝的抑制特性，例如，諸如金黃色葡萄球菌(s.aureus)，人葡萄球菌(s.hominis)和希拉腸球菌(e.hirae)。

16、乳酸乳球菌是一種眾所周知的益生菌生物，幾千年來(lái)一直被廣泛用于不同的目的，如奶酪生產(chǎn)。乳酸乳球菌還已知用于細(xì)菌素生產(chǎn)(如羊毛硫細(xì)菌素乳酸鏈球菌素(lantibiotic?nisin))，可作為針對(duì)某些種類的其它致病菌(如葡萄球菌屬的細(xì)菌)的抑制劑。然而，普通的乳酸乳球菌細(xì)菌僅釋放有限數(shù)量的抗微生物活性肽，其在與其他細(xì)菌的直接對(duì)抗中引起抑制。因此，令人驚訝的是，與已知的乳酸乳球菌菌株相比，乳酸乳球菌菌株10123對(duì)許多微生物表現(xiàn)出優(yōu)異的抗生素特性。

17、本發(fā)明的菌株顯示出對(duì)耐抗生素微生物也出奇地有效。抗生素抗性微生物(特別是細(xì)菌)正在世界范圍內(nèi)迅速出現(xiàn)，危及抗生素的功效，而抗生素已經(jīng)改變了醫(yī)學(xué)并拯救了數(shù)百萬(wàn)人的生命。在第一批患者接受抗生素治療之后幾十年，細(xì)菌感染再次成為一個(gè)威脅。因此，提供對(duì)抗這些抗生素抗性微生物的手段和方法是非常重要的。乳酸乳球菌菌株10123被證明能夠預(yù)防和/或抑制抗生素抗性微生物的生長(zhǎng)。

18、特別是金黃色葡萄球菌及其耐抗生素形式的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant?staphylococcus?aureus，mrsa)是一種令人關(guān)注的人病原體，且是例如皮膚感染、呼吸道感染和食物中毒的原因。例如，在不同的研究中，通過(guò)抗生素消除金黃色葡萄球菌失調(diào)(一種嚴(yán)重的皮膚病)有很好的改善作用。將本發(fā)明的菌株用在全身和局部藥物中可能是對(duì)抗多重耐藥細(xì)菌傳播的有用應(yīng)用。

19、本發(fā)明菌株的另一優(yōu)選應(yīng)用涉及化妝品。到目前為止，化妝品主要使用益生元(prebiotic)(有益的皮膚菌群)或后生元(postbiotic)(裂解物或細(xì)菌代謝物)試劑。此外，細(xì)菌成分或死細(xì)菌具有免疫調(diào)節(jié)作用。然而，活細(xì)菌的使用帶來(lái)了額外的益處。這在直接抑制病原體(如白色念珠菌(c.albicans)或者金黃色葡萄球菌)中尤為重要。

20、乳酸乳球菌菌株10123產(chǎn)生了足夠數(shù)量的抗菌活性物質(zhì)，因此該菌株也可以用作食品添加劑(例如，作為防腐劑)。本發(fā)明的另一方面涉及一種包括乳酸乳球菌10123的組合物。

21、本發(fā)明的另一方面涉及用于生產(chǎn)穩(wěn)定的水凝膠-細(xì)胞組合物的試劑盒，所述組合物包括至少一種可聚合底物和至少一種能夠聚合所述至少一種底物的酶。