本發明屬于分子生物學，具體涉及一種高濃度丙二酸鹽耐受菌株及其構建方法和應用。

背景技術：

1、作為一種重要的微生物胞內中間代謝產物，丙二酰輔酶a是合成脂肪酸、黃酮和聚酮類等多種高附加值化合物的關鍵前體物質，這些產品在醫藥、食品、化工及生物燃料等多個領域具有重要的應用價值。因此，構建丙二酰-coa高產平臺菌株對于下游衍生物的高效綠色生物合成至關重要。目前研究主要通過增強丙二酰-coa供給，減少丙二酰-coa消耗以及精細調控丙二酰-coa水平等代謝工程策略來提升菌株生產丙二酰-coa下游衍生物的能力。然而，大腸桿菌等模式生物中主要的丙二酰-coa合成路徑是乙酰輔酶a羧化酶催化乙酰輔酶a生成丙二酰-coa，且胞內乙酰輔酶a羧化酶合成受到嚴格和復雜的調控。因此，丙二酰-coa的供給能力仍然不足，這成為下游衍生物高效合成的重要限制因素之一。丙二酸又稱胡蘿卜酸、甜菜酸或縮蘋果酸，是一種c3-二羧酸，其分子結構中兼有羧基和活性亞甲基兩種官能團，因而能參加各種化學反應，是制造各種高附加值化學品的基本原料，可作為底物增強乙酰輔酶a羧化酶-coa及其衍生物的合成。同時，丙二酸在三羧酸循環中可作為琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑，抑制微生物細胞的生長代謝，從而限制了目標物質產量和產率的進一步提升。

2、dna聚合酶ⅰ是以親代dna為模板，催化底物dntp分子聚合形成子代dna的一種酶。在dna復制及傳代中發揮著只管重要的作用，特點是：1）具有5’→3’聚合酶活性，這決定了dna只能沿著5’→3’方向合成；2）dna聚合酶不能催化dna新鏈從頭合成，只能催化dntp加入核苷酸鏈的3'-oh末端；3）dna聚合酶都屬于多功能酶，在dna復制和修復過程的不同階段發揮著復制、校對、修復的作用。

3、研究表明，大腸桿菌的dna聚合酶ⅰ經過枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶處理后，原來的酶分子切成兩個片段，其中部分水解生成的c末端605個氨基酸殘基片段為klenow片段，該片段保留了dna聚合酶i的5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性，但缺少完整酶的5’→3’外切酶活性，常用于cdna第二鏈合成，雙鏈dna?3’-末端的標記；dna聚合酶?i（dna-pol?i）斷開后的另一個氨基酸殘基片段，保留5’→3’外切酶活性。因此，可以運用基因優化技術構建出耐受高濃度丙二酸鹽且高產3-羥基丙酸的優化菌株。

技術實現思路

1、本發明的目的是提供了一種高濃度丙二酸鹽耐受菌株及其構建方法和應用。本發明構建出能夠耐受高濃度丙二酸鹽且高產3-羥基丙酸的優化菌株，以達到提高優化菌株耐受能力及3-羥基丙酸合成能力，降低菌株生長中抗性壓力的目的，同時填補了目前高濃度丙二酸鹽耐受菌株構建方法中的空白。

2、為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

3、本發明提供了一種高濃度丙二酸鹽耐受菌株的構建方法，其包括以下步驟：

4、（1）分別優化 matb、mcr、smatpqm、pola*基因后并擴增，得到優化后的 matb、mcr、 smatpqm、pola*基因片段；

5、（2）以大腸桿菌基因組為模版，擴增得到 ilvg、efeu、lafu、pola基因片段的上下游同源臂；

6、（3）以所述步驟（1）中優化后的 matb、mcr、smatpqm、pola*基因片段和所述步驟（2）中 ilvg、efeu、lafu、pola基因片段的上下游同源臂為模板，分別擴增得到重疊片段 livg- matb、重疊片段 efeu-mcr、重疊片段 lafu-smatpqm和重疊片段 pola-pola*；

7、（4）以質粒 pgrb為模版，利用根據 livg、efeu、lafu、pola基因片段設計的grna引物，擴增得到 pgrb-grna載體片段；擴增產物經回收、克隆、轉化和篩選，得到質粒 pgrb- grna；

8、（5）將重疊片段 livg-matb、質粒 pgrb-grna轉化感受態細胞，經抗性篩選后得到整合菌株 δilvg::matb；

9、（6）將重疊片段 efeu-mcr、質粒 pgrb-grna轉化整合菌株 δilvg::matb，經抗性篩選后得到菌株 δilvg::matbδefeu::mcr；

10、（7）將重疊片段 lafu-smatpqm、質粒 pgrb-grna轉化菌株 δilvg::matbδefeu:: mcr，經抗性篩選后得到菌株 δilvg::matbδefeu::mcrδlafu::smatpqm；

11、（8）將重疊片段 pola-pola*、質粒 pgrb-grna轉化菌株 δilvg::matbδefeu::mcr δlafu::smatpqm，經抗性篩選后得到高濃度丙二酸鹽耐受菌株 δilvg::matbδefeu::mcr δlafu::smatpqmδpola::pola*。

12、進一步的，所述構建方法包括以下步驟：

13、（1）分別優化 matb、mcr、smatpqm、pola*基因后并擴增，得到優化后的 matb、mcr、 smatpqm、pola*基因片段；

14、（2）以大腸桿菌 e.?coli?mg1655的基因組為模版，擴增得到 (ilvg)-up、(ilvg)- down、(efeu)-up、(efeu)-down、(lafu)-up、(lafu)-down、(pola)-up、(pola)-down；

15、（3）以所述步驟（1）中優化后的 matb、mcr、smatpqm、pola*基因片段和所述步驟（2）中 (ilvg)-up、(ilvg)-down、(efeu)-up、(efeu)-down、(lafu)-up、(lafu)-down、(pola)- up、(pola)-down為模板，分別擴增得到重疊片段 (livg)up?-matb-(livg)down、重疊片段( efeu)up?–?mcr-( efeu)down、重疊片段( lafu)up?-smatpqm-( lafu)down和重疊片段( pola)up?-?pola*-( pola)down；

16、（4）以質粒 pgrb為模版，分別利用根據 livg、efeu、lafu、pola基因片段設計的grna引物，擴增得到 pgrb-grna載體片段；擴增產物經回收、克隆、轉化和篩選，相對應的得到質粒 pgrb-grna1、pgrb-grna2、pgrb-grna3和 pgrb-grna4；

17、（5）將重疊片段 (livg)up?-matb-(livg)down、質粒 pgrb-grna1轉化感受態細胞 e.? coli?mg1655，經抗性篩選后得到整合菌株 e.?coli?mg1655δilvg::matb；

18、（6）將重疊片段 (efeu)up?–?mcr-(efeu)down、質粒 pgrb-grna2轉化整合菌株 e.? coli?mg1655δilvg::matb，經抗性篩選后得到菌株 e.?coli?mg1655δilvg::matbδ efeu::mcr；

19、（7）將重疊片段 (lafu)up?-smatpqm-(lafu)down、質粒 pgrb-grna3轉化菌株 e.? coli?mg1655δilvg::matbδefeu::mcr，經抗性篩選后得到菌株 e.?coli?mg1655δilvg:: matbδefeu::mcrδlafu::smatpqm；

20、（8）將重疊片段 (pola)up?-?pola*-(pola)down、質粒 pgrb-grna4轉化菌株 e.? coli?mg1655δilvg::matbδefeu::mcrδlafu::smatpqm，經抗性篩選后得到高濃度丙二酸鹽耐受菌株 e.?coli?mg1655δilvg::matbδefeu::mcrδlafu::smatpqmδpola:: pola*。

21、進一步的，所述步驟（1）中優化后的 matb、mcr、smatpqm、pola*基因片段的核苷酸序列分別如seq?id?no.5所示、seq?id?no.6所示、seq?id?no.7所示、seq?id?no.8所示。

22、進一步的，所述步驟（2）的擴增引物序列分別如seq?id?no.9~?seq?id?no.24所示。

23、進一步的，所述步驟（3）中重疊片段 (livg)up?-matb-(livg)down的擴增引物序列如seq?id?no.9和seq?id?no.12所示；所述重疊片段 ?(efeu)up?–?mcr-(efeu)down的擴增引物序列如seq?id?no.13和seq?id?no.16所示；所述重疊片段 ?(lafu)up?-smatpqm- (lafu)down的擴增引物序列如seq?id?no.17和seq?id?no.20所示；所述重疊片段 (pola)up? -?pola*-(pola)down的擴增引物序列如seq?id?no.21和seq?id?no.24所示。

24、進一步的，所述步驟（4）中grna引物的序列分別如seq?id?no.33~?seq?id?no.40所示。

25、本發明還提供了所述的構建方法構建得到的耐受菌株在生產3-羥基丙酸中的應用。

26、進一步的，所述耐受菌株的使用方法為：

27、（1）37℃活化所述耐受菌株；

28、（2）活化后的耐受菌株按照1%-5%的接種量轉接至發酵培養基中，37℃培養至對數生長期后，加入丙二酸鹽，37℃繼續發酵培養，得到發酵液；

29、（3）將所述發酵液離心得到的上清液進行超濾，再利用hplc測定3-羥基丙酸的濃度。

30、進一步的，所述步驟（2）中丙二酸鹽為丙二酸鈉，其濃度為300?mm~500?mm；加入丙二酸鹽后所述的發酵培養時間為16-18h。

31、進一步的，所述發酵培養基的配方為：k2hpo4?9.8?g/l、一水合檸檬酸?2.1?g/l、檸檬酸鐵銨?0.3?g/l、牛肉膏?9?g/l、葡萄糖?20?g/l，高壓滅菌后冷卻，加入1?ml1000倍的微量元素和2?ml硫酸鎂儲存液，混勻。

32、進一步的，所述hplc測定3-羥基丙酸的濃度的條件為：色譜柱：aminex?hpx87?氫柱；流動相：2.5?mm硫酸；流速：0.4?ml/min；柱溫：50?℃；示差檢測器溫度：45?℃。

33、本發明與現有技術相比，具有以下優點和有益效果：

34、1、本發明首先利用基因組整合技術將以丙二酸為底物產3-羥基丙酸的代謝途徑整合至 e.?coli?mg1655以構建底盤菌株，以實現基因的長期穩定表達，且避免了載體表達的生長壓力；然后根據優化菌株生長測定反應基因結果，驗證出優化菌株的高濃度丙二酸鹽的耐受性；對優化菌株進行搖瓶發酵培養，通過高效液相色譜法檢測驗證優化菌株相較于野生型菌株對3-羥基丙酸的產量顯著提高。

35、2、本發明的菌株構建方法包括菌株代謝途徑基因組整合、基因組基因優化、菌株生長測定、搖瓶發酵培養及高效液相色譜檢測法測定，通過將五種方法有機地結合在一起，實現對耐受高濃度丙二酸鹽及高產3-羥基丙酸優化菌株的構建，本發明的方法普適性強、簡單有效、可有效減緩菌株生長的抗性壓力。