本申請實施例涉及細胞重編程的，尤其是涉及重編程培養基及毛絲鼠體細胞重編程為多能干細胞的方法。

背景技術：

1、多能干細胞是一類具有分化為多種細胞類型潛能的干細胞，因其具備自我更新和分化潛能，在再生醫學、疾病研究和藥物篩選等領域具有廣泛的應用前景。其中，誘導多能干細胞（ipsc）是通過體細胞重新編程而產生的多能干細胞，在細胞重編程過程中，分化的體細胞在特定條件下被重編程后，恢復至全能性狀態，或者形成胚胎干細胞系。在細胞重編程時，誘導多能干細胞通常需要重編程培養基進行培養誘導，目前，常規的重編程培養基主要包括dmem基礎培養基和營養物質等。

2、現階段，已有部分對人、小鼠、豬、牛、羊等動物細胞進行重編程案例的文獻和報道，在動物細胞的重編中，通過常規重編程培養基可成功誘導培養ipsc。基于報道的動物細胞的重編程案例，研究人員以期利用毛絲鼠體細胞重編程獲取毛絲鼠ips。毛絲鼠體型小而肥胖，尾端的毛長而蓬松，是花栗鼠類動物，因其全身的柔軟致密絨毛而得名，毛絲鼠體細胞通過細胞重編程獲得毛絲鼠ips，后期再將毛絲鼠ips在體外進行定向分化，最終于體外獲得毛絲鼠囊結構，毛絲鼠囊結構生長出的毛絲鼠毛發可作為綠色皮草，通過毛絲鼠體細胞經毛絲鼠ips定向分化獲得毛絲鼠毛發的方式，具有重要的科研潛力。

3、然而，已實現重編程細胞的動物與毛絲鼠種屬差異較大，和毛絲鼠最接近的物種也僅是同屬于一個目，通過現有技術難以由毛絲鼠體細胞重編程獲得毛絲鼠ips。

技術實現思路

1、為了解決上述問題，本申請的第一方面的發明目的，在于提供一種重編程培養基，通過培養基ⅰ和培養基ⅱ的誘導培養，可成功獲得毛絲鼠ipsc，且有利于提高細胞的重編程效率。

2、本申請的第二方面的發明目的，在于提供毛絲鼠體細胞重編程為多能干細胞的方法，步驟簡便，培養基ⅰ和培養基ⅱ依次培養和誘導細胞，有利于在提高細胞重編程效率的同時獲得高質量的毛絲鼠ipsc。

3、為了實現上述目的，本發明提供了如下技術方案：

4、第一方面，本發明的重編程培養基，包括培養基ⅰ和培養基ⅱ；

5、所述培養基ⅰ為≥5v/v%的血清替代物、≥0.2v/v%的nucleosides（核苷）、≥0.2v/v%的glutamax（l-丙氨酰-l-谷氨酰胺）、0.1mm~10mm的neaa（nonessential?amino?acids，非必需氨基酸）、0.02mm~1mm的2-巰基乙醇、1000~3000u/ml的lif（白血病抑制因子）、0.3μm~10μm的pd0325901和0.1μm~10μm的chir-99021的dmem培養基；所述培養基ⅱ為c57bl/6小鼠胚胎干細胞完全培養基。

6、在一些實現方式中，所述c57bl/6小鼠胚胎干細胞完全培養基含5v/v%~30v/v%的fbs、0.2v/v%~3v/v%的glutamine、0.2v/v%~3v/v%的neaa、0.01~0.1v/v%的lif、0.05v/v%~0.3v/v%的2-巰基乙醇。

7、在一些實現方式中，所述培養基ⅰ和培養基ⅱ均包括0.1v/v%~3v/v%的penicillin/streptomycin雙抗（青霉素/鏈霉素雙抗）。

8、在一些實現方式中，所述培養基ⅰ的血清替代物為5v/v%~20v/v%，所述nucleosides為0.2v/v%~3v/v%，所述glutamax為0.2v/v%~3v/v%。

9、第二方面，本發明的毛絲鼠體細胞重編程為多能干細胞的方法，采用上述所述的重編程培養基，包括以下步驟：

10、毛絲鼠體細胞經重編程轉染轉錄因子，毛絲鼠體細胞重編程轉染后依次使用培養基ⅰ和培養基ⅱ培養。

11、在一些實現方式中，所述轉錄因子為oct4、sox2、lin28、klf4、mp53dd、ebna1和l-myc。

12、在一些實現方式中，所述培養基ⅰ培養，其培養時間為2~5天。

13、在一些實現方式中，所述培養基ⅱ培養，其培養時間為≥5天。

14、在一些實現方式中，所述培養基ⅱ培養時，其細胞要在飼養層上培養。

15、在一些實現方式中，所述毛絲鼠體細胞經真皮細胞培養基培養后，再經重編程轉染轉錄因子，其中，所述真皮細胞培養基含15v/v%~25v/v%的fbs、0.4v/v%~1v/v%的penicillin/streptomycin雙抗，余量為dmem高糖培養基。

16、基于上述技術技術方案，本發明具有如下技術效果：

17、1、本發明提供的重編程培養基，能讓毛絲鼠體細胞（真皮細胞）重編程分化為誘導多能干細胞。其所需試劑少，成本低。

18、2、本發明提供的毛絲鼠體細胞重編程為誘導多能干細胞的方法，首次實現了毛絲鼠體細胞的重編程。首先用培養基ⅰ通過lif、pd0325901和chir-99021等試劑的協同啟動轉染重編程因子的真皮細胞重編程為多能干細胞，然后更換培養基ⅱ可有效促進毛絲鼠體細胞（真皮細胞）重編程。搭配培養基ⅰ和培養基ⅱ使用，其分化效率高。

技術特征：

1.一種重編程培養基，其特征在于，包括培養基ⅰ和培養基ⅱ；

2.根據權利要求1所述的重編程培養基，其特征在于，所述c57bl/6小鼠胚胎干細胞完全培養基含5v/v%~30v/v%的fbs、0.5v/v%~3v/v%的glutamine、0.5v/v%~3v/v%的neaa、0.01~0.1v/v%的lif、0.05v/v%~0.3v/v%的2-巰基乙醇。

3.根據權利要求1或2所述的重編程培養基，其特征在于，所述培養基ⅰ和培養基ⅱ均包括0.1v/v%~3v/v%的penicillin/streptomycin雙抗。

4.根據權利要求1所述的重編程培養基，其特征在于，所述培養基ⅰ的血清替代物為5v/v%~20v/v%，所述nucleosides為0.2v/v%~3v/v%，所述glutamax為0.2v/v%~3v/v%。

5.一種毛絲鼠體細胞重編程為多能干細胞的方法，其特征在于，采用上述權利要求1-4任意一項所述的重編程培養基，包括以下步驟：

6.根據權利要求5所述的毛絲鼠體細胞重編程為多能干細胞的方法，其特征在于，所述轉錄因子為oct4、sox2、lin28、klf4、mp53dd、ebna1和l-myc。

7.根據權利要求5所述的毛絲鼠體細胞重編程為多能干細胞的方法，其特征在于，所述培養基ⅰ培養，其培養時間為2~5天。

8.根據權利要求5所述的毛絲鼠體細胞重編程為多能干細胞的方法，其特征在于，所述培養基ⅱ培養，其培養時間為≥5天。

9.根據權利要求5所述的毛絲鼠體細胞重編程為多能干細胞的方法，其特征在于，所述培養基ⅱ培養時，其細胞要在飼養層上培養。

10.根據權利要求5所述的毛絲鼠體細胞重編程為多能干細胞的方法，其特征在于，所述毛絲鼠體細胞經真皮細胞培養基培養后，再經重編程轉染轉錄因子，其中，所述真皮細胞培養基含15%~25v/v%的fbs、0.4v/v%~1v/v%的penicillin/streptomycin雙抗，余量為dmem高糖培養基。

技術總結
本發明實施例涉及細胞重編程技術領域，公開了一種重編程培養基及毛絲鼠體細胞重編程為多能干細胞的方法，其中，該培養基包括培養基Ⅰ和培養基Ⅱ；培養基Ⅰ為≥5v/v%的血清替代物、≥0.2v/v%的Nucleosides、≥0.2v/v%的GlutaMax、0.1mM~10.0mM的NEAA、0.02mM~1mM的2?巰基乙醇、1000~3000U/mL的LIF、0.3μM~10μM的PD0325901和1μM~10μM的CHIR?99021的DMEM培養基；培養基Ⅱ為C57BL/6小鼠胚胎干細胞完全培養基。方法包括：毛絲鼠體細胞經重編程轉染轉錄因子，毛絲鼠體細胞重編程轉染后依次使用培養基Ⅰ和培養基Ⅱ培養。應用本發明的技術方案，能夠成功獲得毛絲鼠IPSC。

技術研發人員：顧鴻斌
受保護的技術使用者：廣州華越腎科再生醫學科技有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28