本發(fā)明屬于獸醫(yī)免疫學(xué)和分子生物學(xué)，涉及一種具有免疫增強作用的寄生蟲蛋白肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、寄生蟲是一類常見的病原，在長期進化過程中獲得了適應(yīng)宿主并依賴宿主的能力。寄生蟲在宿主體內(nèi)寄生生活的建立，是蟲體與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的結(jié)果。宿主試圖通過免疫應(yīng)答阻止寄生蟲的感染，而寄生蟲則通過各種機制逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。在寄生蟲感染過程中，減少具有免疫抑制作用或增加具有免疫刺激性作用可破壞“寄生蟲-宿主”之間的平衡，從而提高宿主的抗感染能力。

2、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（haemonchus?contortus）是毛圓科血矛屬線蟲，寄生在牛、羊等反芻動物的皺胃中，吸血，引起動物貧血。研究發(fā)現(xiàn)，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染過程中，多種排泄分泌蛋白（esp）可與宿主單個核細胞（pbmc）結(jié)合。進一步研究其中es-15蛋白，發(fā)現(xiàn)該esp能促進山羊pbmc產(chǎn)生il-17等細胞因子，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗蟲免疫；但同時該蛋白也能抑制宿主ifn-γ等細胞因子的表達，表現(xiàn)出免疫抑制作用。類似的結(jié)果還在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲arf1、es-24等排泄分泌蛋白中發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明捻轉(zhuǎn)血矛線蟲通過其蟲體蛋白調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)，使得宿主免疫系統(tǒng)不被強烈的激活，從而有利于寄生蟲的寄生。

3、為篩選es-15蛋白中具有刺激宿主免疫反應(yīng)而不具有免疫抑制作用的肽段，發(fā)明人通過軟件分析和動物試驗，鑒定了es15-1肽段，發(fā)現(xiàn)該肽段能上調(diào)宿主il-12、ifn-γ、il-17、il-1、il-6、tnf-α等細胞因子的表達，說明該肽段具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用。為進一步應(yīng)用該肽段，將其與口蹄疫疫苗聯(lián)合使用，分析了該寄生蟲蛋白肽段用作動物疫苗佐劑的潛力。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供具有免疫增強作用的寄生蟲蛋白肽。

2、本發(fā)明的又一目的是提供該寄生蟲蛋白肽的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的另一目的是提供由該寄生蟲蛋白肽制備的納米顆粒及應(yīng)用。

4、本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

5、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲多肽es15-1，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

6、所述的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲es15-1肽段通過以下方法制備：用實驗室保存的重組hces-15質(zhì)粒為模板，以seq?id?no.8和seq?id?no.9所示的引物進行pcr擴增，獲得基因片段插入pet-32a載體得到含有es15-1基因的重組表達質(zhì)粒pet32a-es15-1；將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行誘導(dǎo)表達并分離純化獲得所述的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲多肽es15-1。

7、編碼所述的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲多肽es15-1的基因，優(yōu)選核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

8、所述的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲多肽es15-1的以下任意一種或多種應(yīng)用：

9、（a1）制備動物免疫增強劑；

10、（a2）制備具有免疫增強作用的納米顆粒。

11、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的動物選自小鼠、山羊或豬。

12、所述的編碼所述的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲多肽es15-1的基因的以下任意一種或多種應(yīng)用：

13、（b1）在制備重組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲多肽es15-1；

14、（b2）制備動物免疫增強劑；

15、（b3）制備具有免疫增強作用的納米顆粒。

16、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的動物選自小鼠、山羊或豬。

17、一種具有免疫增強作用的納米顆粒，為plga包裹的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲多肽es15-1。

18、所述的納米顆粒的制備方法，包含以下步驟：

19、將plga溶于二氯甲烷制備3%-5%的plga溶液，按照每1?ml?所述的plga溶液中加入1-2?ml?5%的pva溶液和3-7?mg多肽es15-1的量加入pva和多肽es15-1；用攪拌、超聲波處理后形成初乳液；在初乳液中加入與第一次加入的pva溶液等量的?5%的pva溶液，用超聲波處理形成復(fù)乳液；復(fù)乳液中有機溶劑完全揮發(fā)后進行超速離心，沉淀物用純水溶解，冷凍干燥，從而獲取裝載有重組多肽es15-1的納米顆粒。

20、優(yōu)選包含以下步驟：將plga溶于二氯甲烷制備5%的溶液，按照每1?ml?5%的plga溶液中加入2?ml?5%的pva和5?mg重組es15-1；用攪拌、超聲波處理后形成初乳液；在初乳液中加入2?ml?5%的pva，用超聲波處理形成復(fù)乳液；復(fù)乳液中有機溶劑完全揮發(fā)后進行超速離心，沉淀物用2ml純水溶解，冷凍干燥，從而獲取裝載有重組多肽es15-1的納米顆粒。

21、所述的超聲波處理條件為：超聲功率40w，超聲5s，間隔5s。

22、所述的納米顆粒的以下任意一種應(yīng)用：

23、（c1）在制備動物免疫增強劑；

24、（c2）制備動物疫苗。

25、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的動物選自小鼠、山羊或豬。

26、本發(fā)明建立在下列發(fā)現(xiàn)之上：

27、發(fā)現(xiàn)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲排泄分泌蛋白es-15對山羊具有多重免疫調(diào)節(jié)作用，篩選出其中es15-1片段具有刺激宿主免疫系統(tǒng)的作用。

28、經(jīng)plga包被后的肽段，在動物體內(nèi)具有良好的緩釋作用，可以更持久的刺激免疫系統(tǒng)。

29、有益效果：

30、1.?通過分段表達篩選出具有免疫增強作用的肽段，有較好的免疫調(diào)節(jié)作用。

31、2.?相比較天然蛋白，重組蛋白表達量高，易獲得。

32、3.?重組es15-1具有良好的安全性。

33、4.?重組蛋白es15-1可提高疫苗的免疫保護效果。

技術(shù)特征：

1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲多肽es15-1，其特征在于，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.編碼權(quán)利要求1所述的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲多肽es15-1的基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

4.權(quán)利要求1所述的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲多肽es15-1的以下任意一種或多種應(yīng)用：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的動物選自小鼠、山羊或豬。

6.權(quán)利要求2所述的基因的以下任意一種應(yīng)用：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的動物選自小鼠、山羊或豬。

8.一種具有免疫增強作用的納米顆粒，其特征在于，為plga包裹的權(quán)利要求1所述的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲多肽es15-1。

9.權(quán)利要求8所述的納米顆粒的以下任意一種或多種應(yīng)用：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的動物選自小鼠、山羊或豬。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛋白肽的鑒定和應(yīng)用。本發(fā)明鑒定出了一種可用作免疫增強劑的寄生蟲蛋白肽，其氨基酸序列如?SEQ?ID?NO.4?所示。該多肽可以上調(diào)小鼠和山羊IL?12、IFN?γ、IL?17、IL?6、IL?1和TNF?α的表達，抑制IL?4和TGF?β的表達，對動物Th1和Th17型免疫反應(yīng)具有刺激作用，對Th2和Treg型免疫反應(yīng)有抑制作用。該寄生蟲蛋白肽與口蹄疫疫苗聯(lián)合使用，表現(xiàn)出較好的免疫增強效果，具有潛在的應(yīng)用前景。該寄生蟲蛋白肽具有易制備，產(chǎn)量高，穩(wěn)定性好，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。

技術(shù)研發(fā)人員：嚴若峰,陸明敏,陳程,李祥瑞,宋小凱,徐立新
受保護的技術(shù)使用者：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28