一種縊蟶活性三肽及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物活性膚領(lǐng)域，尤其涉及一種溢賠活性H膚及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 溢賠（Sinonova州Iaconstricta)俗名賠子，屬瓣離綱、異齒亞綱、簾始目、燈培始 科、溢賠屬，在我國(guó)沿海均有分布，產(chǎn)量較大，為我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一。溢賠肉味鮮美、性 寒、營(yíng)養(yǎng)豐富，富含人體生命活動(dòng)所需的各種必需氨基酸、不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可補(bǔ)陰 去邪熱，治煩悶、冷癡、熱癡、婦人產(chǎn)后虛損、虛熱等癥，具有較高的藥用食用價(jià)值。
[0003] 活性膚是由兩個(gè)或兩個(gè)W上的氨基酸W膚鍵相連的化合物，在人體內(nèi)起重要生理 作用，發(fā)揮生理功能，如；調(diào)節(jié)體內(nèi)的水分、電解質(zhì)平衡；促進(jìn)傷口愈合；修復(fù)細(xì)胞、改善細(xì) 胞代謝，能起到防癌作用等。活性膚一般通過酶解生物活性材料獲得，鄭惠娜等發(fā)現(xiàn)食物蛋 白通過蛋白酶酶解方式，可W得到功能多樣的活性多膚（《海洋蛋白酶解制備生物活性膚 的研究進(jìn)展》，鄭惠娜、章超枠、曹文紅，水產(chǎn)科學(xué)，2008, 27 (7)，370)。在對(duì)溢賠肉的蛋白酶 解產(chǎn)物研究方面，雷曉凌等對(duì)溢賠肉的酶解條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)提取得到的糖胺聚糖對(duì)體 外培養(yǎng)的化-60細(xì)胞均有一定抑制作用，且隨著用量增加抑制作用增強(qiáng)（《溢賠糖胺聚糖 的提取分離及其體外抗腫瘤活性的初步研究》，雷曉凌、吳紅棉、范秀萍等，藥物生物技術(shù)， 2004,11(3) =146-149);張永娟等研究發(fā)現(xiàn)提取的溢賠多膚能促進(jìn)小鼠胸腺和脾臟發(fā)育及 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生，提高小鼠碳廓清能力及血清溶血素水平（《溢賠多膚的免疫調(diào)節(jié)及 抗氧化作用》，張永娟、鄭惠娜，時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011,22巧）；1076-1077)。然而，上述研究一 般僅涉及溢賠蛋白酶解多膚混合物的研究，對(duì)具體的功能性多膚單體未進(jìn)一步進(jìn)行研究， 本申請(qǐng)通過提取溢賠活性H膚，對(duì)溢賠的抗腫瘤活性進(jìn)行進(jìn)一步研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種溢賠活性H膚。
[0005] 本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種上述溢賠活性H 膚的制備方法。
[0006] 本發(fā)明所要解決的第H個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種上述溢賠活性H 膚的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為；一種溢賠活性H膚，其氨基酸系 列為；Asp-Tyr-HiS。
[0008] -種如權(quán)利要求1所述的溢賠活性H膚的制備方法，包括W下步驟：
[0009] (1)新鮮溢賠去殼取肉，洗凈后搗碎，按料液比1:1~3加水進(jìn)行組織勻漿，勻漿后 調(diào)節(jié)勻漿液抑值為2~3. 5備用；
[0010] (2)在上述勻漿液中加入胃蛋白酶進(jìn)行酶解，獲取酶解樣品，酶解溫度為30~ 45°C，加酶量為300~1200U/g溢賠肉，酶解時(shí)間為2~化，酶解完成后于95~IOOC、10~ 15min進(jìn)行滅酶；
[0011] (3)將上述酶解樣品過5KD、8KD超濾膜進(jìn)行超濾，分別收集分子量大于8邸、分子 量為8~5KDW及分子量小于5KD的酶解液組進(jìn)行冷凍干燥；
[0012] (4)對(duì)步驟（3)中收集各分子量段的酶解液分別進(jìn)行反相高效液相色譜純化，收 集各峰組分并進(jìn)行氨基酸測(cè)序，獲得所述溢賠活性H膚。
[0013] 作為優(yōu)選，溢賠活性H膚的制備方法為；（1)新鮮溢賠去殼取肉，洗凈后搗碎，按 料液比1:1加水進(jìn)行組織勻漿，勻漿后調(diào)節(jié)勻漿液抑值為3備用；
[0014] (2)在上述勻漿液中加入胃蛋白酶進(jìn)行酶解，獲得酶解樣品，酶解溫度為45C，加 酶量為300U/g溢賠肉，酶解時(shí)間為化，酶解完成后于95~IOOtMO~15min進(jìn)行滅酶；
[0015] (3)將上述酶解樣品過5KD超濾膜進(jìn)行超濾，收集分子量小于5KD的酶解液進(jìn)行冷 凍干燥；
[0016] (4)對(duì)步驟（3)中收集的酶解液進(jìn)行反相高效液相色譜純化，收集各峰組分并進(jìn) 行氨基酸測(cè)序，獲得所述溢賠活性H膚；
[0017] 前述反相高效液相色譜條件為；AgilentC18色譜柱4. 6X250mmSum,檢測(cè)波長(zhǎng) 280皿，柱溫為20°C，進(jìn)樣量為IOOul，梯度洗脫，流速為1.Oml/min，流動(dòng)相A為0. 06%TFA， B為0. 05 %TFA的己臘，洗脫程序；0 %~1 %B洗脫4分鐘，O%~7 %B洗脫25分鐘，7 %~ 100%B洗脫1分鐘，100 %~100%B洗脫5分鐘。
[0018] 一種上述溢賠活性H膚在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0019] 所述抗腫瘤為抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性，所述腫瘤為人前列腺癌。
[0020] 進(jìn)一步，所述溢賠活性H膚對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖抑制率與濃度和作用 時(shí)間呈依賴關(guān)系，當(dāng)濃度為5~15mg/ml，作用時(shí)間為24~72h時(shí)，增殖抑制率為49. 75~ 98. 94%。
[002。 再進(jìn)一步，所述溢賠活性H膚的濃度為lOmg/ml，作用時(shí)間為7化時(shí)，對(duì)人前列腺 癌PC-3細(xì)胞的最大增殖抑制率為98. 94%。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于；本發(fā)明提供了一種全新的溢賠活性H膚， 能較好地抑制人前列腺癌細(xì)胞增殖活性，對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞的最大增殖抑制率可達(dá) 98. 94%，體外抗前列腺癌效果顯著，可為抗前列腺癌藥物的研究提供理論基礎(chǔ)。該溢賠活 性H膚通過生物酶解方式獲得，原料來源廣泛，成本低，同時(shí)模擬人體內(nèi)部消化環(huán)境，采用 胃蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解方式溫和，酶解產(chǎn)品貼合人體自然需要，對(duì)進(jìn)一步研究和開發(fā)W溢 賠為基礎(chǔ)的藥物、提供溢賠的經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重大意義。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中分子量小于5KD的酶解液反相高效液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]W下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[002引實(shí)施例1 ;溢賠活性立膚的制備
[002引 1、前處理：
[0027] 取新鮮溢賠，去殼取溢賠肉，洗凈后漸干備用。
[0028]2、胃蛋白酶解
[0029] 2.I用高速組織搗碎機(jī)將溢賠肉搗碎，加入蒸傭水勻漿，料液比I:I~3,精密稱取 勻漿液，用0.Imol/L的鹽酸溶液和0.Imol/L的化OH溶液調(diào)節(jié)勻漿液抑值，加入胃蛋白 酶酶解數(shù)小時(shí)，酶解條件為：酶解溫度30~45°C，抑為2~3. 5,酶解時(shí)間2~化，加酶量 300~1200U/g溢賠肉。酶解結(jié)束后于100°C下滅酶15min，4°C下離必15min(10000r/min)， 取上清液備用。
[0030] 2.2胃蛋白酶解工藝優(yōu)化
[003。2.2. 1選用胃蛋白酶，WA(溫度）、B(pH)、C(加酶量）、D(料液比）和E(時(shí)間）5 個(gè)因素，選4個(gè)水平進(jìn)行Lw(45)的正交實(shí)驗(yàn)，通過MT法篩選在不同酶解條件下的酶解液 對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖抑制率最高的酶解條件，從而確定最佳水解條件，并進(jìn)行大量酶解。胃 蛋白酶因素和水平如表1所示：
[0032]表1胃蛋白酶的因素與水平
[0034] 2. 2. 2本實(shí)施例中選取前列腺癌細(xì)胞PC-3激素非依賴型細(xì)胞（原購(gòu)自中科院上海 細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存），細(xì)胞培養(yǎng)過程如下：
[00對(duì)（1)、細(xì)胞復(fù)蘇
[0036] 從液氮罐中取出存放的PC-3細(xì)胞株，快速的放入37C恒溫水浴鍋中進(jìn)行融化，待 融化后進(jìn)入無菌工作室進(jìn)行操作，用滅菌好的吸管將細(xì)胞株吸入離必管，加入2mL的F12營(yíng) 養(yǎng)液或RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液，100化pm離必lOmin，去上清液，加入4ml的營(yíng)養(yǎng)液，反復(fù)吹打使 細(xì)胞成為單個(gè)細(xì)胞。然后用吸管將細(xì)胞均勻的吸入到2個(gè)25mL的培養(yǎng)瓶中，放入5% 0)2、 37C的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日換液倒掉未貼壁的死亡細(xì)胞。
[0037] 似、細(xì)胞培養(yǎng)
[0038] 將人前列腺癌細(xì)胞PC-3接種到分別含有10 %胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)）FBS和雙抗 (青霉素GlOOIU/mL、鏈霉素lOOIU/mL)的F12和1640營(yíng)養(yǎng)液中，放置于37°C、5%C〇2的恒 溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每1天換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的80%左右時(shí)進(jìn)行傳 代。按照1 : 2的比例進(jìn)行傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[00測(cè)（3)、細(xì)胞傳代
[0040] 先將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶從恒溫培養(yǎng)箱中取出放到無菌操作臺(tái)上。傳代時(shí)，先倒掉 瓶中的營(yíng)養(yǎng)液，去除不貼壁生長(zhǎng)的死細(xì)胞，用0. 25%膜蛋白酶/0. 02%邸TA消化液混合消 化，不同細(xì)胞消化的時(shí)間不同，一般消化時(shí)間為3-5min;顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞間隙明 顯變大且細(xì)胞變圓變亮?xí)r，說明細(xì)胞已經(jīng)消化完畢，去掉消化酶液。在培養(yǎng)瓶中加入2. 5mL 左右的營(yíng)養(yǎng)液，反復(fù)吹打消化好的貼壁細(xì)胞使之成為單個(gè)細(xì)胞，一般情況下一瓶細(xì)胞傳2 瓶，將傳代好的細(xì)胞置于37°C、5%C〇2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0041] (4)'MTT法