一種海帶降壓肽的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種海帶降壓肽的制備方法，屬于降壓肽制備技術領域。本發明取海帶洗滌粉碎后，經超聲波和CO2超臨界萃取得含海帶蛋白質的溶液備用，再取蛋白胨等制得培養基，接種芽孢桿菌培養得芽孢桿菌菌種，與牛肉膏等混合發酵，離心后得蛋白酶液，與備用含海帶蛋白質溶液混合反應，過濾得濾液，加入活性炭等混合，過濾再經濃縮干燥制得海帶降壓肽。本發明的有益效果是：本發明制備步驟簡單，產物易分離，無微生物侵染變質現象發生，可控性強；所得降壓肽產率和活性高，純度高達99.2%以上。
【專利說明】
一種海帶降壓肽的制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種海帶降壓肽的制備方法，屬于降壓肽制備技術領域。
【背景技術】
[0002]高血壓是引起心血管疾病的主要原因之一，它發病率高，常伴有心臟、血管、肺以及腎臟等器官功能性或器質性改變，是引發心、腦、腎和眼等各種并發癥和導致中風、動脈粥樣硬化、冠心病的一個重要危險因子。降壓肽抑制ACE酶，使得血管緊張素無法轉化為具有強升壓作用的血管緊張素同時保持具有血管舒張作用緩激肽的生物活性，從而達到降壓的目的。由于海洋生態環境的特殊性，使得海洋生物源蛋白質具有多種特異性氨基酸的組成和序列，海洋生物源蛋白質水解后暴露出降壓的活性位點，從而使海洋生物源活性肽具有降壓效果。同時，海洋生物源蛋白活性肽具有低抗原性的特點，安全性高，無毒副作用。因此海洋生物源蛋白質是制備降壓肽的重要藥源，海洋生物源降壓肽的開發將成為高血壓非藥物治療的重要組成部分。但利用海蜇或其他海洋動植物資源提取得到降壓肽，但得到的產物基本是粗體蛋白質或者離心上清液，降壓肽部分得率低、純度低以及活性保存不好，且待分離產物為多肽混合物，屬高碳源、氮源，極易受到微生物的侵染發生變質，而不易分離。

【發明內容】

[0003]本發明所要解決的技術問題:針對利用海洋動植物資源提取得到降壓肽，降壓肽得率低、純度低，且待分離產物為多肽混合物，屬高碳源、氮源，極易受到微生物的侵染發生變質，而不易分離的弊端，提供了一種取海帶洗滌粉碎后，經超聲波和CO2超臨界萃取得含海帶蛋白質的溶液備用，再取蛋白胨等制得培養基，接種芽孢桿菌培養得芽孢桿菌菌種，與牛肉膏等混合發酵，離心后得蛋白酶液，與備用含海帶蛋白質溶液混合反應，過濾得濾液，加入活性炭等混合，過濾再經濃縮干燥制得海帶降壓肽的方法。本發明制備步驟簡單，產物易分離，無微生物侵染變質現象發生，有效解決了降壓肽得率和純度低問題。
[0004]為解決上述技術問題，本發明采用如下所述的技術方案是:
(1)稱取30?50g海帶，用去離子水洗滌3?5次，并用粉碎機粉碎，將海帶粉末加入燒杯中，向燒杯中加入300?400mL去離子水，并置于3000?3200W超聲波萃取機中，超聲提取30?40min，過濾，得到濾液；
(2)將上述濾液置于CO2超臨界萃取儀中，再加入200?300mL去離子水，控制萃取壓力為30?35MPa，萃取溫度為40?50 V，CO2流量為30?40kg/h，萃取30?40min，得含海帶蛋白質的溶液，備用；
(3)依次稱取10?15g蛋白胨、10?15g牛肉膏、5?7g氯化鈉加入培養皿中，再加入800?I OOOmL去離子水，攪拌5?1min，制成培養基，接種3?5株芽孢桿菌到培養基上，再將培養基置于搖床中，在40?420C下，振蕩培養72?74h，將培養液放入7000?8000r/min離心機中離心分離30?40min，棄去上清液，得芽孢桿菌菌種；
(4)向發酵罐中依次加入3?5g牛肉膏、5?7g氯化鈉、5?7g蛋白胨、600?800mL去離子水，攪拌10?20min，再加入10?20%上述所得芽孢桿菌菌種，攪拌均勾后，在45?55 °C下，發酵24?26h，待發酵結束，將發酵液在7000?8000r/min下離心20?30min，棄去下層雜質，得蛋白酶液；
(5)將上述蛋白酶液加入燒瓶中，將燒瓶置于水浴鍋中，控制溫度為45?55°C，再向燒瓶中加入步驟(2)備用的含海帶蛋白質溶液，攪拌反應2?3h，隨后將溫度升至90?100°C，攪拌20?30min，過濾得濾液，向濾液中依次加入2?4g活性炭、3?5g磁性水凝膠，攪拌10?20min，過濾得海帶降壓肽溶液，將其減壓蒸餾至原體積1/4，并置于-20?-10°C真空冷凍干燥器中，冷凍干燥10?12h，碾磨得粉末，即海帶降壓肽。
[0005]本發明的應用方法:將本發明制得的海帶降壓肽放入模具中，控制溫度為20?30°C，壓制成型，制得藥片，每片藥片重10?llmg，每日早晚各一片。該降壓肽活性高，可有效預防高血壓，降低高血壓的發病率，提高人體免疫功能，促進人體消化吸收。
[0006]本發明與其他方法相比，有益技術效果是:
(1)本發明制備步驟簡單，產物易分離，無微生物侵染變質現象發生，可控性強；
(2)所得降壓肽產率和活性高，純度高達99.2%以上。
【具體實施方式】
[0007]首先稱取30?50g海帶，用去離子水洗滌3?5次，并用粉碎機粉碎，將海帶粉末加入燒杯中，向燒杯中加入300?400mL去離子水，并置于3000?3200W超聲波萃取機中，超聲提取30?40min，過濾，得到濾液；然后將上述濾液置于⑶2超臨界萃取儀中，再加入200?300mL去離子水，控制萃取壓力為30?35MPa，萃取溫度為40?50°C，C02流量為30?40kg/h，萃取30?40min，得含海帶蛋白質的溶液，備用；再依次稱取10?15g蛋白胨、10?15g牛肉膏、5?7g氯化鈉加入培養皿中，再加入800?100mL去離子水，攪拌5?1min，制成培養基，接種3?5株芽孢桿菌到培養基上，再將培養基置于搖床中，在40?42°C下，振蕩培養72?74h，將培養液放入7000?8000r/min離心機中離心分離30?40min，棄去上清液，得芽孢桿菌菌種；向發酵罐中依次加入3?5g牛肉膏、5?7g氯化鈉、5?7g蛋白胨、600?800mL去離子水，攪拌10?20min，再加入10?20%上述所得芽孢桿菌菌種，攪拌均勾后，在45?55 °C下，發酵24?26h，待發酵結束，將發酵液在7000?8000r/min下離心20?30min，棄去下層雜質，得蛋白酶液;最后將上述蛋白酶液加入燒瓶中，將燒瓶置于水浴鍋中，控制溫度為45?55°C，再向燒瓶中加入備用的含海帶蛋白質溶液，攪拌反應2?3h，隨后將溫度升至90?100 °C，攪拌2 O?3 O m i η，過濾得濾液，向濾液中依次加入2?4 g活性炭、3?5 g磁性水凝膠，攪拌1?20min，過濾得海帶降壓肽溶液，將其減壓蒸餾至原體積1/4，并置于-20?-10°C真空冷凍干燥器中，冷凍干燥10?12h，碾磨得粉末，即海帶降壓肽。
[0008]實例I
首先稱取30g海帶，用去離子水洗滌3次，并用粉碎機粉碎，將海帶粉末加入燒杯中，向燒杯中加入300mL去離子水，并置于3000W超聲波萃取機中，超聲提取30min，過濾，得到濾液；然后將上述濾液置于CO2超臨界萃取儀中，再加入200mL去離子水，控制萃取壓力為30MPa，萃取溫度為40°C，CO2流量為30kg/h，萃取30min，得含海帶蛋白質的溶液，備用;再依次稱取1g蛋白胨、1g牛肉膏、5g氯化鈉加入培養皿中，再加入800mL去離子水，攪拌5min，制成培養基，接種3株芽孢桿菌到培養基上，再將培養基置于搖床中，在40°C下，振蕩培養72h，將培養液放入7000r/min離心機中離心分離30min，棄去上清液，得芽孢桿菌菌種；向發酵罐中依次加入3g牛肉膏、5g氯化鈉、5g蛋白胨、600mL去離子水，攪拌1min，再加入10%上述所得芽孢桿菌菌種，攪拌均勻后，在45 V下，發酵24h，待發酵結束，將發酵液在7000r/min下離心20min，棄去下層雜質，得蛋白酶液;最后將上述蛋白酶液加入燒瓶中，將燒瓶置于水浴鍋中，控制溫度為45°C，再向燒瓶中加入備用的含海帶蛋白質溶液，攪拌反應2h，隨后將溫度升至90°C，攪拌20min，過濾得濾液，向濾液中依次加入2g活性炭、3g磁性水凝膠，攪拌lOmin，過濾得海帶降壓肽溶液，將其減壓蒸餾至原體積1/4，并置于-20°C真空冷凍干燥器中，冷凍干燥1h，碾磨得粉末，即海帶降壓肽。
[0009]將本發明制得的海帶降壓肽放入模具中，控制溫度為20°C，壓制成型，制得藥片，每片藥片重10mg，每日早晚各一片。該降壓肽活性高，可有效預防高血壓，降低高血壓的發病率，提高人體免疫功能，促進人體消化吸收。
[0010]實例2
首先稱取40g海帶，用去離子水洗滌4次，并用粉碎機粉碎，將海帶粉末加入燒杯中，向燒杯中加入350mL去離子水，并置于3100W超聲波萃取機中，超聲提取35min，過濾，得到濾液；然后將上述濾液置于CO2超臨界萃取儀中，再加入250mL去離子水，控制萃取壓力為33MPa，萃取溫度為45°C，CO2流量為35kg/h，萃取35min，得含海帶蛋白質的溶液，備用;再依次稱取13g蛋白胨、13g牛肉膏、6g氯化鈉加入培養皿中，再加入900mL去離子水，攪拌8min，制成培養基，接種4株芽孢桿菌到培養基上，再將培養基置于搖床中，在41°C下，振蕩培養73h，將培養液放入7500r/min離心機中離心分離35min，棄去上清液，得芽孢桿菌菌種；向發酵罐中依次加入4g牛肉膏、6g氯化鈉、6g蛋白胨、700mL去離子水，攪拌15min，再加入15%上述所得芽孢桿菌菌種，攪拌均勻后，在50 V下，發酵25h，待發酵結束，將發酵液在7500r/min下離心25min，棄去下層雜質，得蛋白酶液;最后將上述蛋白酶液加入燒瓶中，將燒瓶置于水浴鍋中，控制溫度為50°C，再向燒瓶中加入備用的含海帶蛋白質溶液，攪拌反應3h，隨后將溫度升至95°C，攪拌25min，過濾得濾液，向濾液中依次加入3g活性炭、4g磁性水凝膠，攪拌15min，過濾得海帶降壓肽溶液，將其減壓蒸餾至原體積1/4，并置于-15°C真空冷凍干燥器中，冷凍干燥I Ih，碾磨得粉末，即海帶降壓肽。
[0011]將本發明制得的海帶降壓肽放入模具中，控制溫度為25°C，壓制成型，制得藥片，每片藥片重llmg，每日早晚各一片。該降壓肽活性高，可有效預防高血壓，降低高血壓的發病率，提高人體免疫功能，促進人體消化吸收。
[0012]實例3
首先稱取50g海帶，用去離子水洗滌5次，并用粉碎機粉碎，將海帶粉末加入燒杯中，向燒杯中加入400mL去離子水，并置于3200W超聲波萃取機中，超聲提取40min，過濾，得到濾液；然后將上述濾液置于CO2超臨界萃取儀中，再加入300mL去離子水，控制萃取壓力為35MPa，萃取溫度為50°C，CO2流量為40kg/h，萃取40min，得含海帶蛋白質的溶液，備用;再依次稱取15g蛋白胨、15g牛肉膏、7g氯化鈉加入培養皿中，再加入100mL去離子水，攪拌1min，制成培養基，接種5株芽孢桿菌到培養基上，再將培養基置于搖床中，在42°C下，振蕩培養74h，將培養液放入8000r/min離心機中離心分離40min，棄去上清液，得芽孢桿菌菌種；向發酵罐中依次加入5g牛肉膏、7 g氯化鈉、7 g蛋白胨、800mL去離子水，攪拌20min，再加入20%上述所得芽孢桿菌菌種，攪拌均勻后，在55 °C下，發酵26h，待發酵結束，將發酵液在8000r/min下離心30min，棄去下層雜質，得蛋白酶液;最后將上述蛋白酶液加入燒瓶中，將燒瓶置于水浴鍋中，控制溫度為55°C，再向燒瓶中加入備用的含海帶蛋白質溶液，攪拌反應3h，隨后將溫度升至100°C，攪拌30min，過濾得濾液，向濾液中依次加入4g活性炭、5g磁性水凝膠，攪拌20min，過濾得海帶降壓肽溶液，將其減壓蒸餾至原體積1/4，并置于-10°C真空冷凍干燥器中，冷凍干燥12h，碾磨得粉末，即海帶降壓肽。
[0013]將本發明制得的海帶降壓肽放入模具中，控制溫度為30°C，壓制成型，制得藥片，每片藥片重llmg，每日早晚各一片。該降壓肽活性高，可有效預防高血壓，降低高血壓的發病率，提高人體免疫功能，促進人體消化吸收。
【主權項】
1.一種海帶降壓肽的制備方法，其特征在于具體制備步驟為: (1)稱取30?50g海帶，用去離子水洗滌3?5次，并用粉碎機粉碎，將海帶粉末加入燒杯中，向燒杯中加入300?400mL去離子水，并置于3000?3200W超聲波萃取機中，超聲提取30?40min，過濾，得到濾液； (2)將上述濾液置于CO2超臨界萃取儀中，再加入200?300mL去離子水，控制萃取壓力為30?35MPa，萃取溫度為40?50°C，CO2流量為30?40kg/h，萃取30?40min，得含海帶蛋白質的溶液，備用； (3)依次稱取10?15g蛋白胨、10?15g牛肉膏、5?7g氯化鈉加入培養皿中，再加入800?I OOOmL去離子水，攪拌5?1min，制成培養基，接種3?5株芽孢桿菌到培養基上，再將培養基置于搖床中，在40?420C下，振蕩培養72?74h，將培養液放入7000?8000r/min離心機中離心分離30?40min，棄去上清液，得芽孢桿菌菌種； (4)向發酵罐中依次加入3?5g牛肉膏、5?7g氯化鈉、5?7g蛋白胨、600?800mL去離子水，攪拌10?20min，再加入10?20%上述所得芽孢桿菌菌種，攪拌均勾后，在45?55 °C下，發酵24?26h，待發酵結束，將發酵液在7000?8000r/min下離心20?30min，棄去下層雜質，得蛋白酶液； (5)將上述蛋白酶液加入燒瓶中，將燒瓶置于水浴鍋中，控制溫度為45?55°C，再向燒瓶中加入步驟(2)備用的含海帶蛋白質溶液，攪拌反應2?3h，隨后將溫度升至90?100°C，攪拌20?30min，過濾得濾液，向濾液中依次加入2?4g活性炭、3?5g磁性水凝膠，攪拌10?20min，過濾得海帶降壓肽溶液，將其減壓蒸餾至原體積1/4，并置于-20?-10°C真空冷凍干燥器中，冷凍干燥10?12h，碾磨得粉末，即海帶降壓肽。
【文檔編號】C12R1/07GK105907827SQ201610469799
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月26日
【發明人】郭舒洋, 盛海豐, 孟浩影
【申請人】郭舒洋