專利名稱：一種生產產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液的方法
技術領域：
本發明屬于生物領域，特別涉及產乳酸枯草芽孢桿菌的培養方法。
背景技術：
隨著國民經濟的快速發展和人民生活水平的日益提高，人們對養殖環境及安全、健康的動物產品提出了更高、更新的要求。而近些年來，頻頻曝光的動物食品安全事件，如“瘦肉精事件”、“三聚氰胺奶事件”等等，無一不對動物養殖業造成了沉重地打擊，引發了嚴重的信任危機。中國作為世界第一動物養殖大國，動物產品出口在國民經濟中舉足輕重，但近年來歐洲、日本等一些國家以食品安全問題為壁壘，拒絕中國動物產品的部分進入，給我 國經濟造成不應有的損失。這一系列的問題都是“動物產品安全”問題所致，已成為制約中國養殖業科學健康和可持續發展的瓶頸。國際上目前普遍認為，微生態制劑在未來的動物養殖中將有巨大的應用前景，對解決動物產品安全性將起到較大的作用。我國雖然在微生態制劑的研究和開發方面比歐美起步晚，但近20年來發展相當迅速。生產微生態制劑的廠家由2000年的十幾家發展到2004年的1600家。據不完全統計，到2004年止，我國的各種微生態制劑的產量已達到15萬噸。產業化程度高、規模較大的有四川何明清用芽孢桿菌研制的8501、8701、8801、8901、901系列，分別用于仔豬、育肥豬、魚、禽、肉雞。大連醫學院研制劑的“促菌生”，南京農大研的“促康生”，松江制藥廠生產的DM423菌粉，黑龍江獸醫研究所生產的“痢康粉劑”，北京營養研究所生產的“增菌素”，杭州商學院生產的乳酸菌復合劑等等。市場上應用較多、效果較好的大多是以芽孢桿菌和乳酸桿菌為主的復合益生菌口服制劑。對產乳酸枯草芽孢桿菌進行發酵生產，綜合枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌的優點，可以使微生態制劑性能得到質的飛躍，達到更新換代的目的。大規模發酵生產乳酸枯草芽孢桿菌菌液是新型微生態制劑生產的基礎和關鍵之一，但目前未有工廠化大規模發酵生產乳酸枯草芽孢桿菌菌液的發酵工藝。

發明內容
本發明的目的在于提供一種培養基配方、培養基制備方法及其獲得的培養基，該配方及培養基成本低，取材方便，適用于產乳酸枯草芽孢桿菌的培養；該培養基的制備方法簡單，適用于大規模制備。為實現上述目的，本發明的技術方案為產乳酸枯草芽孢桿菌的培養基配方，按重量份計具體由以下組分組成蛋白胨1-5份，牛肉膏1-3份，酵母提取物1-10份，氯化鈉5-15份，果寡糖10-100份。進一步，產乳酸枯草芽孢桿菌的培養基配方，按重量份計具體由以下組分組成蛋白胨3份，牛肉膏2份，酵母提取物7份，氯化鈉11份，果寡糖75份。果寡糖，又稱為果聚糖、低聚果糖、藤果二糖族低聚糖，分子式為G-F-Fn (其中G為匍甸糖，F為果糖，η = 13)。
所述的培養基配方制備培養基的方法，取配方量的蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物及氯化鈉，加入適量的水使蛋白胨的質量體積分數為l_5g/L，并使各組分充分溶解，得混合液體；將所述混合液體滅菌，加入配方量的果寡糖混合均勻，得培養基。所述的方法制備的培養基。該培養基為產乳酸枯草芽孢桿菌的專用培養基，在特定的發酵條件下，可得到較好的發酵效果。本發明的目的之二在于提供生產產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液的方法，該方法操作簡單，穩定性高，產率高。為實現上述目的，本發明的技術方案為所述的培養基生產產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液的方法，具體包括以下步驟將生產產乳酸枯草芽孢桿菌種子液接種到裝有所述培養基的發酵罐中進行動態發酵，動態發酵條件為30-37°C條件下連續培養24-72小時，通氣量為O. 1-0. 5V/V -min,靜置培養96-120小時，得產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液。 進一步，所述動態發酵條件為在2-20轉/分鐘條件下動態攪拌發酵。作為優選，所述種子液和培養基的體積比為1-4 10，所述發酵罐的裝液量為10-20ml/100mL，所述種子液的濃度為3_15 X 108cfu/mL,發酵罐的裝液量優選為20mL/100mL。其中，所述種子液為二級種子液。其中，所述二級種子液的獲得方法具體包括以下步驟A—級種子液的獲得將產乳酸枯草芽孢桿菌菌種接入營養肉湯，37°C培養24小時；然后劃線接種在營養瓊脂平板上，在生化培養箱中，經37°C、24-48小時培養后選典型菌落接種營養瓊脂斜面若干支，置37°C、生化培養箱中培養24小時，作為一級種子；產乳酸枯草芽孢桿菌菌種接入營養肉湯時，接種量優選lml/lOOmL ；B 二級種子液的獲得取一級種子接種于營養肉湯，置37°C生化培養箱中培養24小時，得二級種子，一級種子接種于營養肉湯接種量優選2ml/100mL ；營養肉湯的制備方法為蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水至IOOOmL,調節PH7. 4 ;按上述成分混合，溶解后校正pH，分裝燒瓶，每瓶225mL，121°C高壓滅菌15min，得營養肉湯。本發明的有益效果在于基于所述培養基的培養方法，可用于規模化生產產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液，其工藝穩定，益生菌含量高，生產成本低。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例中，產乳酸枯草芽孢桿菌CSY1-3-10-1株作為菌種。實施例I培養基的制備配方一產乳酸枯草芽孢桿菌的培養基配方，按重量份計具體由以下組分組成蛋白胨I份，牛肉膏I份，酵母提取物I份，氯化鈉15份，果寡糖100份。配方二 產乳酸枯草芽孢桿菌的培養基配方，按重量份計具體由以下組分組成蛋白胨5份，牛肉膏3份，酵母提取物10份，氯化鈉5份，果寡糖10份。配方三產乳酸枯草芽孢桿菌的培養基配方，按重量份計具體由以下組分組成蛋白胨3份，牛肉膏2份，酵母提取物7份，氯化鈉11份，果寡糖75份。將上述 三種配方按以下步驟制備取配方量的蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物及氯化鈉，加入適量的水使蛋白胨的質量體積分數為3g/L(l-5g/L均可)，并使各組分充分溶解，得混合液體；將所述混合液體滅菌，加入配方量的果寡糖混合均勻，配方一、二和三依次得培養基一、培養基二和培養基三O實施例2培養基的應用一所述的培養基生產產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液的方法，具體包括以下步驟將生產產乳酸枯草芽孢桿菌種子液(濃度為3X108cfu/mL)接種到裝有所述培養基(配方三)的發酵罐中進行10轉/分鐘動態發酵，發酵條件為30°C連續培養24小時后，再靜置培養96小時，得產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液。經計數，產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液中產乳酸枯草芽孢桿菌的含菌數大于I. 80X10lclCFU/mL。二將產乳酸枯草芽孢桿菌菌種接入所述培養基(配方二 )，37± 1°C培養24小時；然后劃線接種在營養瓊脂平板上，在生化培養箱中，在37土1°C條件下培養24-48小時，選典型菌落接種營養瓊脂斜面，置37± I°C、生化培養箱中培養24小時，作為一級種子。三取一級種子接種于所述培養基(配方一)，置37± I°C生化培養箱中培養24小時，得二級種子。實施例3生產產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液的方法I 二級種子液的獲得方法具體包括以下步驟A) 一級種子液的獲得將產乳酸枯草芽孢桿菌菌種接入營養肉湯(接種量lml/lOOmL)，37±1°C培養24小時；然后劃線接種在營養瓊脂平板上，在生化培養箱中，經37°C、48小時培養后選典型菌落接種營養瓊脂斜面若干支，置37°C、生化培養箱中培養24小時,作為一級種子液(濃度為3X108cfu/mL)；B) 二級種子液的獲得取一級種子接種于營養肉湯(接種量2ml/100mL),置37± 1°C生化培養箱中培養24小時，得二級種子液(濃度為15X 108cfu/mL)。2產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液的方法具體包括以下步驟將生產產乳酸枯草芽孢桿菌的所述二級種子接種到裝有所述培養基(實施例I中的所述培養基三)的發酵罐中進行動態發酵，發酵條件為37°C連續培養(2-20轉/分鐘動態攪拌發酵，通氣量為O. 1-0. 5V/V · min) 72小時后，再靜置培養120小時，得產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液。所述種子液和培養基的體積比為4 10，所述發酵罐的裝液量為20ml/100mL。經計數，產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液中產乳酸枯草芽孢桿菌的含菌數大于2. 20X 101(lCFU/mL。實施例4用實施例3的方法制備生產產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液，經噴霧干燥等(參數干燥能力0· 1-2. OKg水/小時；干燥時間1· 0-1. 5秒；最大空氣流量35m3/h ;壓縮空氣流量1000-3000L/ h ;溫度90-220°C;加熱控溫精度±2°C )最后制成產乳酸枯草芽孢桿菌微生態合生元飼料添加劑。實驗室試制生產了 5批共100千克實驗室制微生態合生元飼料添加劑，批號分別為2011001、2011002、2011003、2011004、2011005。添加劑生產過程中，嚴格按半成品和成品檢驗規定進行檢驗，半成品生產和檢驗報告結果見表1，成品質量檢驗情況見表2 (5批實驗室試制產品成品的原始檢驗報告詳見后)。表I乳酸枯草芽孢桿菌微生態合生元飼料添加劑半成品生產和檢驗結果
權利要求
1.產乳酸枯草芽孢桿菌的培養基配方，其特征在于，按重量份計具體由以下組分組成蛋白胨1-5份，牛肉膏1-3份，酵母提取物1-10份，氯化鈉5-15份，果寡糖10-100份。
2.根據權利要求I所述的培養基配方，其特征在于，按重量份計具體由以下組分組成蛋白胨3份，牛肉膏2份，酵母提取物7份，氯化鈉11份，果寡糖75份。
3.權利要求I或2所述的培養基配方制備培養基的方法，其特征在于，取配方量的蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物及氯化鈉，加入適量的水使蛋白胨的質量體積分數為l_5g/L，并使各組分充分溶解，得混合液體；將所述混合液體滅菌，加入配方量的果寡糖混合均勻，得培養基。
4.權利要求3所述的方法制備的培養基。
5.基于權利要求4所述的培養基生產產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液的方法，其特征在于，具體包括以下步驟將產乳酸枯草芽孢桿菌種子液接種到裝有所述培養基的發酵罐中進行動態發酵，發酵條件為30-37°C條件下連續培養24-72小時，通氣量為O. 1-0. 5V/V -min,再靜置培養96-120小時，得產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述動態發酵條件為在2-20轉/分鐘條件下動態攪拌發酵。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述種子液和所述培養基的體積比為1-4 10，所述發酵罐的裝液量為10-20mL/100mL，所述種子液的濃度為3-15X108cfu/mL。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述種子液為二級種子液。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述二級種子液的獲得方法具體包括以下步驟 A—級種子液的獲得 將產乳酸枯草芽孢桿菌菌種接入營養肉湯，37土 1°C培養24小時；然后劃線接種在營養瓊脂平板上，在生化培養箱中，在37土1°C條件下培養24-48小時，選典型菌落接種營養瓊脂斜面，置37± I°C、生化培養箱中培養24小時，作為一級種子； B二級種子液的獲得 取一級種子接種于營養肉湯，置37± I°C生化培養箱中培養24小時,得二級種子。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，在所述步驟A或/和所述步驟B中，營養肉湯替換為所述培養基。
全文摘要
本發明屬于生物領域，特別涉及產乳酸枯草芽孢桿菌發酵工藝及配方，按重量份計具體由以下組分組成蛋白胨1-5份，牛肉膏1-3份，酵母提取物1-10份，氯化鈉5-15份，果寡糖10-100份；發酵工藝為將生產產乳酸枯草芽孢桿菌種子液接種到裝有所述培養基的發酵罐中進行發酵，發酵條件為30-37℃連續培養24-72小時后靜置培養96-120小時，得產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液；基于所述培養基的培養方法，可用于規模化生產產乳酸枯草芽孢桿菌合生元飼料添加劑用菌液，其工藝穩定，益生菌含量高，生產成本低。
文檔編號A23K1/16GK102845614SQ20121033441
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者楊金龍, 劉作華, 黃勇, 付利芝, 鄭華, 張素輝, 楊睿, 沈克飛 申請人:重慶市畜牧科學院