本發明涉及根腫病防治領域，具體地，涉及一種抑制蕓薹根腫菌生長的方法，防治十字花科作物根腫病的方法以及阿扎霉素在防治十字花科作物根腫病中的用途。
背景技術：
：十字花科作物根腫病是由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)侵染引起的。此病1852年首次在美國報道，19世紀在前蘇聯大面積流行并造成毀滅性災害。近年來，此病在世界范圍內危害日趨嚴重。我國早在1936年在臺灣就有報道，目前主要分布在黑龍江、遼寧、山東、新疆、甘肅、陜西、江蘇、浙江、福建、江西、湖北、湖南等地區。植株受到蕓薹根腫菌侵染后，根系和地下莖部分或全部組織形成膨大的腫瘤。受害輕者，地上部組織外觀沒有明顯的癥狀；受害嚴重者，營養吸收和水分運輸受到中斷，上部表現營養不良和萎蔫，植株表現不同程度的萎黃；對于幼嫩苗則上部葉片萎垂，導致未成熟而死亡，生長發育受到嚴重障礙，根腫病菌能侵染十字花科多種作物，一般損失20％左右，嚴重的損失70-80％，甚至絕產無收，嚴重威脅著十字花科作物的生產。對于十字花科作物根腫病的防治，目前主要的措施有檢疫、抗病品種、輪作、調節土壤的pH值和化學防治等方法，但還沒有理想的措施。因此，符合環保、健康和持續發展理念的生物農藥在十字花科作物根腫病的治理中越來越引起人們的關注，尤其是微生物及其活性次生代謝產物的應用，因其具有廣譜性以及對環境安全的優點已成為根腫病防治的新手段，表現出廣闊的應用前景，因此，探尋更多的用于防治十字花科作物根腫病的生藥藥劑具有重要的意義。技術實現要素：本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種抑制蕓薹根腫菌生長的方法和防治十字花科作物根腫病的方法以及阿扎霉素在防治十字花科作物根腫病中的用途。為了實現上述目的，本發明的發明人進行了大量實驗，結果發現阿扎霉素對抑制蕓薹根腫菌的侵染具有優異的效果。因此，第一方面，本發明提供了一種抑制蕓薹根腫菌生長的方法，該方法包括將阿扎霉素與蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)進行接觸。第二方面，本發明提供了一種防治十字花科作物根腫病的方法，該方法包括將阿扎霉素施用至十字花科作物。第三方面，本發明提供了阿扎霉素在防治十字花科作物根腫病中的用途。通過上述技術方案，能夠有效地防治十字花科作物根腫病，并且，由于阿扎霉素可以通過微生物手段獲得，具有環境安全的優點，因此，具有廣闊的應用前景。本發明的其它特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。具體實施方式以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。在本文中所披露的范圍的端點和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應當理解為包含接近這些范圍或值的值。對于數值范圍來說，各個范圍的端點值之間、各個范圍的端點值和單獨的點值之間，以及單獨的點值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數值范圍，這些數值范圍應被視為在本文中具體公開。在本發明中，在未作相反說明的情況下，使用的術語“抑制蕓薹根腫菌生長”指的是蕓薹根腫菌的生長和繁殖被抑制，具體表現是一段時間后孢子死亡。本發明中使用的術語“防治”意指預防和/或治療。本發明使用的“蕓薹根腫菌”是粘菌門，根腫菌綱的代表生物，該菌營寄生生活，常寄生于十字花科作物的根部，使寄主患根腫病。第一方面，本發明提供了一種抑制蕓薹根腫菌生長的方法，該方法包括將阿扎霉素與蕓薹根腫菌進行接觸。本發明使用的“阿扎霉素”主要是從鏈霉菌屬產生的次級代謝產物中發現的大環內酯類抗生素，其主要包括阿扎霉素F(AzalomycinF)類化合物。優選地，所述阿扎霉素為阿扎霉素F3(AzalomycinF3)和/或阿扎霉素F4(AzalomycinF4)，其中，所述阿扎霉素F3的分子式為C56H95N3O17；和/或，所述阿扎霉素F4的分子式為C57H97N3O17；更優選地，所述阿扎霉素F3的結構如式(I)所示，R為H；和/或，所述阿扎霉素F4的結構如式(I)所示，R為CH3。在本發明中，對所述阿扎霉素F3和阿扎霉素F4的來源沒有特別的限定，可以為本
技術領域：
的常規選擇，例如，可以通過商購獲得，或者可以通過微生物手段獲得。在本發明的一種優選的實施方式中，阿扎霉素F3和阿扎霉素F4通過CN101720772B中的實施例1公開的方法制備獲得。在本發明中，對阿扎霉素與蕓薹根腫菌進行接觸的條件沒有特別的限定，可以為本領域常規使用的條件，例如，所述接觸的溫度可以為25-30℃，優選為25-28℃。根據本發明，所述阿扎霉素的用量使得接觸體系中所述阿扎霉素的濃度為0.5-6ppm，優選為0.5-3ppm。在本發明中，當所述接觸體系為液體或氣體(即意在抑制液體或氣體中的蕓薹根腫菌生長)時，“1ppm”表示的是“1μg/mL”；當所述接觸體系為固體(即意在抑制固體中的蕓薹根腫菌生長)時，“1ppm”表示的是“1μg/g”。第二方面，本發明提供了一種防治十字花科作物根腫病的方法，該方法包括將阿扎霉素施用至十字花科作物。根據本發明，所述阿扎霉素可以按照常規的施用方式對十字花科作物進行施用，優選地，所述阿扎霉素以溶液的形式施用且阿扎霉素溶液的濃度為50-500μg/mL，更優選為100-200μg/mL，進一步優選為200μg/mL。根據本發明，對所述阿扎霉素的施用量沒有特別的限定，可以為5-30mg/株/次，優選地，所述阿扎霉素的施用量為5-20mg/株/次，更優選為10mg/株/次(以8-9葉期十字花科作物為基準)。通常地，根據需要，施用頻率為每隔7-10天施用一次。根據本發明，所述阿扎霉素為阿扎霉素F類化合物；優選地，所述阿扎霉素為阿扎霉素F3和/或阿扎霉素F4，其中，所述阿扎霉素F3的分子式為C56H95N3O17；和/或，所述阿扎霉素F4的分子式為C57H97N3O17；更優選地，所述阿扎霉素F3的結構如式(I)所示，R為H；和/或，所述阿扎霉素F4的結構如式(I)所示，R為CH3。根據本發明，為了更好地防止十字花科作物根腫病，施用的方式可以為灌根、撒施、噴霧和種子處理中的至少一種，優選為灌根和/或撒施，更優選為灌根。根據本發明，對十字花科作物的種類沒有特別的限定，只要是能夠發生根腫病的十字花科作物均在本申請的保護范圍內。在優選的情況下，所述十字花科作物為甘藍、白菜、花椰菜、芥菜、蘿卜、蕪菁和油菜中的至少一種。第三方面，本發明還提供了阿扎霉素在防治十字花科作物根腫病中的用途。所述阿扎霉素為阿扎霉素F類化合物；優選為阿扎霉素F類化合物中的任意一種；更優選為式(I)所示的阿扎霉素F3(R為H)和/或阿扎霉素F4(R為CH3)。阿扎霉素的使用方式(如用量和頻率)如前所述，在此不再贅述。以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。以下實施例中，未特別說明的實驗操作均在常規條件下進行。實驗使用的甘藍、白菜、花椰菜和油菜均種植在云南省騰沖縣界頭鎮(由楊佩文采集)；使用的阿扎霉素F3和阿扎霉素F4通過CN101720772B中的實施例1公開的方法制備獲得。實施例1本實施例用來說明采用阿扎霉素F3抑制蕓薹根腫菌生長的效果。1、蕓薹根腫菌的收集分別采集種植于云南省騰沖縣界頭鎮的已產生根腫病的甘藍、白菜、花椰菜和油菜的病根，將病根組織切片于顯微鏡下觀察，結果在顯微鏡下觀察到休眠孢子囊和游動的休眠孢子，確定為蕓薹根腫菌。將采集到的新鮮病根洗凈、晾干表面水分后備用。將1g病根壓扁，盡量避免破壞根組織，釋放出孢子與50mL的無菌蒸餾水混勻，經15層紗布過濾，濾液再次通過中速濾紙過濾，分裝到50mL的離心管中，于4500rpm下離心10min，棄去上清溶液，沉淀繼續用50mL無菌蒸餾水溶解，重復上述離心過程兩次。將第三次離心獲得的沉淀中加入5mL25重量％濃度的蔗糖，于3100rpm下離心5min，棄掉上清液，沉淀重懸于5mL無菌蒸餾水中，混勻，即獲得分別來自于甘藍、白菜、花椰菜和油菜的蕓薹根腫菌的孢子懸液。2、阿扎霉素F3對蕓薹根腫菌孢子的作用使用無菌蒸餾水分別調節上述蕓薹根腫菌的孢子懸液至適當的密度(1×105個/mL)。將阿扎霉素F3配制成不同濃度(0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL和6μg/mL)的水溶液，以無菌蒸餾水作為對照組，然后與上述分別來自于甘藍、白菜、花椰菜和油菜的蕓薹根腫菌孢子懸液等體積混合，取一滴滴加在凹玻片上，每個處理3重復，在28℃下保濕培養18h后檢查對照孢子的萌發情況。當對照孢子的萌發率達到85％后，檢查所有處理的孢子萌發率，以孢子芽管長度大于孢子長度一半者為萌發，找出孢子萌發抑制率為100％時的阿扎霉素F3濃度，即為最低抑制濃度(MinimumInhibitoryConcentration，MIC)，MIC值越低，說明抑菌活性越強。結果如表1所示，阿扎霉素F3對蕓薹根腫菌的MIC值均小于等于2μg/mL，說明阿扎霉素F3對蕓薹根腫菌的抑制效果較強。表1孢子的來源作用物質MIC值(μg/mL)甘藍阿扎霉素F30.5甘藍無菌蒸餾水—白菜阿扎霉素F32白菜無菌蒸餾水—花椰菜阿扎霉素F31花椰菜無菌蒸餾水—油菜阿扎霉素F31.5油菜無菌蒸餾水—注：“—”表示未檢測到對蕓薹根腫菌的孢子有抑制作用。實施例2本實施例用來說明采用阿扎霉素F4抑制蕓薹根腫菌生長的效果。1、蕓薹根腫菌的收集同實施例1。2、阿扎霉素F4對蕓薹根腫菌孢子的作用按照實施例1的步驟進行，其中，所不同的是使用阿扎霉素F4代替阿扎霉素F3。結果如表2所示，阿扎霉素F4對蕓薹根腫菌的MIC值均小于等于2.5μg/mL，說明阿扎霉素F4對蕓薹根腫菌的抑制效果較強。表2孢子的來源作用物質MIC值(μg/mL)甘藍阿扎霉素F41.0甘藍無菌蒸餾水—白菜阿扎霉素F42.5白菜無菌蒸餾水—花椰菜阿扎霉素F41.5花椰菜無菌蒸餾水—油菜阿扎霉素F42.0油菜無菌蒸餾水—注：“—”表示未檢測到對蕓薹根腫菌的孢子有抑制作用。實施例3本實施例用來說明采用阿扎霉素F3對白菜根腫病防治效果的測定。選擇8-9葉期長勢一致的健康白菜進行預防作用和治療作用的測定。1、預防作用灌根阿扎霉素F3(以200μg/mL的濃度灌根)，24小時后灌根接種濃度為1×105個/mL的由實施例1制備得到的來自于白菜的蕓薹根腫菌的孢子懸液，設無菌蒸餾水為空白對照，三者的灌根量均為50mL/株。接種后置于28℃培養箱中保濕培養。每隔7天施用一次。2、治療作用灌根接種濃度為1×105個/mL的由實施例1制備得到的來自于白菜的蕓薹根腫菌的孢子懸液，設無菌蒸餾水為空白對照，然后置于28℃培養箱中保濕培養72h。之后灌根阿扎霉素F3(以200μg/mL的濃度灌根)，三者的噴施量均為50mL/株。隨后置于28℃培養箱中保濕培養。每隔7天施用一次。30d后調查發病情況，統計病情指數，計算防治效果。病情調查分級標準：病情指數＝[〔∑(病級株數×代表級數)〕/(調查總株數×最高代表級值)]×100防治效果＝[(對照組病情指數-處理組病情指數)/對照組病情指數]×100％阿扎霉素F3對白菜根腫病的防治測試結果如下：對白菜根腫病的預防作用：4次重復平均防治效果為91.6％；對白菜根腫病的治療作用：4次重復平均防治效果為86.4％；由以上結果可以看出，阿扎霉素F3對白菜根腫病具有很好的防治效果。實施例4本實施例用來說明采用阿扎霉素F4對白菜根腫病防治效果的測定。按照實施例3的方法進行，其中，所不同的是，采用阿扎霉素F4代替阿扎霉素F3。阿扎霉素F4對白菜根腫病的防治測試結果如下：對白菜根腫病的預防作用：4次重復平均防治效果為90.4％；對白菜根腫病的治療作用：4次重復平均防治效果為84.2％；由以上結果可以看出，阿扎霉素F4對白菜根腫病具有很好的防治效果。實施例5本實施例用來說明采用阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用對白菜根腫病防治效果的測定。按照實施例3的方法進行，其中，所不同的是，采用以1：1重量比混合的阿扎霉素F3和阿扎霉素F4(以200μg/mL的總濃度灌根)代替阿扎霉素F3。阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用對白菜根腫病的防治測試結果如下：對白菜根腫病的預防作用：4次重復平均防治效果為98.8％；對白菜根腫病的治療作用：4次重復平均防治效果為95.3％；由以上結果可以看出，阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用對白菜根腫病具有很好的防治效果。對比例1按照實施例3的方法進行，其中，所不同的是，采用百菌清代替阿扎霉素F3。百菌清對白菜根腫病的防治測試結果如下：對白菜根腫病的預防作用：4次重復平均防治效果為82.3％；對白菜根腫病的治療作用：4次重復平均防治效果為71.6％。實施例6本實施例用來說明采用阿扎霉素F3對油菜根腫病防治效果的測定。選擇8-9葉期長勢一致的健康油菜進行預防作用和治療作用的測定。1、預防作用撒施阿扎霉素F3(以200μg/mL的濃度撒施)，24小時后撒施接種濃度為3×105個/mL的由實施例1制備得到的來自于油菜的蕓薹根腫菌的孢子懸液，設無菌蒸餾水為空白對照，三者的灌根量均為50mL/株。接種后置于28℃培養箱中保濕培養。每隔7天施用一次。2、治療作用撒施接種濃度為3×105個/mL的由實施例1制備得到的來自于油菜的蕓薹根腫菌的孢子懸液，設無菌蒸餾水為空白對照，然后置于28℃培養箱中保濕培養72h。撒施阿扎霉素F3(以200μg/mL的濃度撒施)，三者的噴施量均為50mL/株。隨后置于28℃培養箱中保濕培養。每隔7天施用一次。30d后調查發病情況，統計病情指數，計算防治效果，具體同實施例3所示。阿扎霉素F3對油菜根腫病的防治測試結果如下：對油菜根腫病的預防作用：4次重復平均防治效果為91.4％；對油菜根腫病的治療作用：4次重復平均防治效果為85.1％；由以上結果可以看出，阿扎霉素F3對油菜根腫病具有很好的防治效果。實施例7本實施例用來說明采用阿扎霉素F4對油菜根腫病防治效果的測定。按照實施例5的方法進行，其中，所不同的是，采用阿扎霉素F4代替阿扎霉素F3。阿扎霉素F4對油菜根腫病的防治測試結果如下：對油菜根腫病的預防作用：4次重復平均防治效果為90.6％；對油菜根腫病的治療作用：4次重復平均防治效果為84.2％；由以上結果可以看出，阿扎霉素F4對油菜根腫病具有很好的防治效果。實施例8本實施例用來說明采用阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用對油菜根腫病防治效果的測定。按照實施例5的方法進行，其中，所不同的是，采用以1：1重量比混合的阿扎霉素F3和阿扎霉素F4(以200μg/mL的總濃度灌根)代替阿扎霉素F3。阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用對油菜根腫病的防治測試結果如下：對油菜根腫病的預防作用：4次重復平均防治效果為97.4；對油菜根腫病的治療作用：4次重復平均防治效果為91.2％；由以上結果可以看出，阿扎霉素F3和阿扎霉素F4配合使用對油菜根腫病具有很好的防治效果。對比例2按照實施例5的方法進行，其中，所不同的是，采用百菌清代替阿扎霉素F3。百菌清對油菜根腫病的防治測試結果如下：對油菜根腫病的預防作用：4次重復平均防治效果為81.8％；對油菜根腫病的治療作用：4次重復平均防治效果為71.1％。通過以上實施例1-8與對比例1-2的結果相對比可以看出，本發明提供的方法能夠有效地防治十字花科作物根腫病，并且，由于阿扎霉素可以通過微生物手段獲得，具有環境安全的優點，因此，具有廣闊的應用前景。以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重復，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。當前第1頁1 2 3