技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及大蒜組織培養(yǎng)與快繁的方法，更具體的說是構(gòu)建一種大蒜根尖分生組織再生的方法。

背景技術(shù)：

大蒜作為無性繁殖作物，生產(chǎn)上多以大蒜瓣為種子進行種植，生產(chǎn)成本高、繁殖系數(shù)低、病毒積累、種性退化等問題嚴重影響大蒜生產(chǎn)。尋找大蒜快繁、脫毒以及種質(zhì)遺傳改良技術(shù)迫在眉睫。前人工作中構(gòu)建了多種大蒜快繁脫毒技術(shù)體系，如用大蒜幼葉、全展葉根尖、莖尖、花序軸等為外植體構(gòu)建大蒜組織培養(yǎng)體系；張素芝等利用大蒜莖盤進行愈傷組織的誘導(dǎo)，并獲得了適宜于愈傷組織增殖分化的培養(yǎng)基；Luciani 等以大蒜莖尖為外植體誘導(dǎo)出再生能力較強的愈傷組織；張昌偉等則通過大蒜根尖直接誘導(dǎo)不定芽，得到試管苗并成功的得到了試管鱗莖。大蒜根尖分生組織處于生長頂端，分生組織細胞分裂快，帶毒量少甚至不帶毒，且一顆蒜瓣可以發(fā)幾條甚至幾十條根，實驗取材方便，較大蒜莖尖比較，每一顆蒜瓣只有一個莖尖，用于愈傷組織誘導(dǎo)的莖尖需要在解剖鏡下剝離，后期的消毒程度對愈傷組織誘導(dǎo)也有一定的影響。

本發(fā)明采用大蒜蒜瓣整體消毒后，無菌條件下發(fā)根，以根尖分生組織為外植體，通過高頻誘導(dǎo)愈傷組織、誘導(dǎo)再生不定芽和試管鱗莖，構(gòu)建再生技術(shù)體系， 所得試管鱗莖均具有儲藏葉，可直接種于大田，易于管理，能明顯提高試管苗的移栽成活率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于公開了一種大蒜根尖分生組織再生的方法，其特征在于按如下的步驟進行：

（1）以大蒜根尖分生組織為外植體誘導(dǎo)愈傷組織：

選取沒有病斑的大蒜鱗莖剝?nèi)ネ馄ず笞詠硭疀_洗30 min，然后于紫外滅菌后的超凈工作臺中用0.1%（w/w）的 HgCl₂浸泡20 min，無菌蒸餾水洗滌2-3次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，無菌蒸餾水洗滌3-5遍后，將大蒜鱗莖接入無菌培養(yǎng)瓶中生根；待根長至2-3cm時，切下大蒜根部，用解剖針縱劃，將其接入篩選培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=5.8；愈傷組織誘導(dǎo)率達97.5%；

（2）大蒜根尖愈傷組織繼代和再分化：

大蒜根尖愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長4周后，可進行繼代，繼代培養(yǎng)約2周時，愈傷組織顆粒感明顯，呈淺黃色，繼代培養(yǎng)4周時，愈傷組織增值明顯，繼代兩次后進行再分化，繼代培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，再分化培養(yǎng)基為：

MS+3 mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+7.5g·L^-1瓊脂，pH=5.8；

（3）試管鱗莖誘導(dǎo)與收獲

再分化培養(yǎng)1周時愈傷組織表面開始出現(xiàn)大量的綠點，2周可以觀察到綠點不斷生長，逐漸形成不定芽，3周時，大部分綠點形成不定芽，4周不定芽長至約2cm，7周后不定芽生長長至5-8 cm的簇生試管苗，將簇生試管苗移入誘導(dǎo)試管鱗莖培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基為MS + 120 g · L^-1 綿白糖 + 6.8 g · L^-1瓊脂， pH=7.5，試管鱗莖成熟后取出，清洗表層培養(yǎng)基后陰干，放4 ℃冰箱低溫儲存。

本發(fā)明進一步公開了大蒜根尖分生組織再生的方法在提高組培苗成活率方面的應(yīng)用。實驗結(jié)果證明：用大蒜無菌根為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率達97.5%；愈傷組織再生率可達85%，試管鱗莖的誘導(dǎo)率達95%以上。通過組培途徑誘導(dǎo)發(fā)育的試管鱗莖對環(huán)境適應(yīng)性強，耐貯藏，易成活。本發(fā)明通過大蒜根尖分生組織誘導(dǎo)的愈傷組織，誘導(dǎo)再生植株進而獲得試管鱗莖，這些試管鱗莖均具有儲藏葉，即均具有發(fā)芽的潛力。為大蒜組織培養(yǎng)途徑脫毒快繁提供了新的技術(shù)方法。

本發(fā)明以大蒜根尖分生組織為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)，誘導(dǎo)再生試管苗，試管苗直接誘導(dǎo)成具有萌發(fā)能力的試管鱗莖，避免了試管苗經(jīng)過生根、煉苗、移栽等繁瑣過程，提高了試管苗成活率。同時與通過莖尖組培途徑相比，雖然根尖和莖尖都處于生長點，都有天然脫毒的效果，但每一個大蒜瓣只有一個莖尖，用于愈傷組織誘導(dǎo)的莖尖需要在解剖鏡下剝離，后期的消毒程度對愈傷組織誘導(dǎo)也有一定的影響；而一個大蒜瓣可以發(fā)出幾條或幾十條根，大蒜瓣可以整體消毒后再進行根的誘導(dǎo)萌發(fā)，實驗取材方便，材料量充足。

本發(fā)明更加詳細的描述如下：

（1）大蒜根尖分生組織獲得：

選取沒有病斑的大蒜鱗莖剝?nèi)ネ馄ず笞詠硭疀_洗30 min，然后于紫外滅菌后的超凈工作臺中用0.1%（w/w）的 HgCl₂浸泡20 min，無菌蒸餾水洗滌2-3次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，無菌蒸餾水洗滌3-5遍后，將大蒜鱗莖接入無菌培養(yǎng)瓶中生根；

（2）以大蒜根尖分生組織為外植體誘導(dǎo)愈傷組織：

待（1）中培養(yǎng)的無菌根長至2-3cm時，切下大蒜根部，用于愈傷組織誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=5.8，誘導(dǎo)率達97.5%。其具體的方法如下：將切下大蒜根用無菌解剖針縱向劃開制造傷口，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)。經(jīng)過1周左右，大蒜根尖分生組織區(qū)出現(xiàn)膨大現(xiàn)象并變?yōu)闇\褐色；大約2周后；大蒜根尖分生組織區(qū)持續(xù)膨大并變?yōu)闇\黃色；3周后大蒜根尖分生組織區(qū)出現(xiàn)明顯的組織結(jié)構(gòu)，呈淺黃色半透明狀態(tài)；大約4周后，大蒜根尖分生區(qū)有明顯的塊狀愈傷組織生成。

（3）大蒜根尖愈傷組織繼代和再分化：

大蒜根尖愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長4周后，可進行繼代。具體方法為：繼代培養(yǎng)約2周時，愈傷組織顆粒感明顯，呈淺黃色。繼代培養(yǎng)約4周時，愈傷組織增值明顯。繼代兩次后進行再分化。繼代培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，再分化培養(yǎng)基為：MS+3 mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+7.5g·L^-1瓊脂，pH=5.8。

（4）試管鱗莖誘導(dǎo)與收獲：

再分化培養(yǎng)1周左右時愈傷組織表面開始出現(xiàn)大量的綠點，約2周左右可以觀察到綠點不斷生長，逐漸形成不定芽，3周左右時，大部分綠點形成不定芽，4周左右不定芽長至約2cm，7周后不定芽長至5-8 cm的簇生試管苗，將簇生試管苗移入誘導(dǎo)試管鱗莖培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基為MS + 120 g · L^-1 綿白糖 + 6.8 g · L^-1瓊脂， pH=7.5，試管鱗莖成熟后取出，清洗表層培養(yǎng)基后陰干，放4 ℃冰箱低溫儲存。

本發(fā)明所述的NAA是 a-萘乙酸（1-naphthlcetic acid），簡稱NAA ； KT是激動素（Kinetin）,簡稱KT；

所述的MS基本培養(yǎng)基配方：

每1L基本培養(yǎng)基中含有：KNO₃ 1900mg, NH₄NO₃ 1650mg, MgSO₄?7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, CaCl₂?2H₂O 440 mg, MnSO₄?4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄?7H₂O 8.6 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, KI 0.83 mg, Na₂MO₃?2H₂O 0.25 mg, CuSO₄?5H₂O 0.025 mg, CoCl₂?6H₂O 0.025 mg, Na₂-EDTA 37.7 mg, FeSO₄?7H₂O 27.8 mg, 甘氨酸2.0 mg, 鹽酸硫胺素0.4 mg, 鹽酸吡哆素0.5 mg, 煙酸0.5 mg, 肌醇100 mg。

下面本發(fā)明以典型的天津市寶坻大蒜快繁為代表，更加具體的說明實施方案：

（1）大蒜根尖分生組織獲得：

選取沒有病斑的寶坻大蒜“六瓣紅”鱗莖，剝?nèi)ネ馄ず笞詠硭疀_洗30 min，然后于紫外滅菌后的超凈工作臺中用0.1%（w/w）的 HgCl₂浸泡20 min，無菌蒸餾水洗滌2-3次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，無菌蒸餾水洗滌3-5遍后，將大蒜鱗莖接入無菌培養(yǎng)瓶中生根；

（2）以大蒜根尖分生組織為外植體誘導(dǎo)愈傷組織：

待（1）中培養(yǎng)的無菌根長至2-3cm時，用無菌手術(shù)刀切下大蒜根部，將切下大蒜根用無菌解剖針縱向劃開制造傷口，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=5.8。經(jīng)過1周左右，大蒜根尖分生組織區(qū)出現(xiàn)膨大現(xiàn)象并變?yōu)闇\褐色；愈傷組織持續(xù)生長，大約2周后，大蒜根尖分生組織區(qū)持續(xù)膨大并變?yōu)闇\黃色；3周后，大蒜根尖分生組織區(qū)出現(xiàn)明顯的組織結(jié)構(gòu)，呈淺黃色半透明狀態(tài)；大約4周后，大蒜根尖分生區(qū)有明顯的塊狀愈傷組織生成。統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率（誘導(dǎo)出愈傷組織根數(shù)/接入培養(yǎng)基總根數(shù)%），最高達97.5%。

（3）大蒜根尖愈傷組織繼代和再分化：

大蒜根尖愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長4周后，可進行繼代。繼代培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。繼代培養(yǎng)約2周時，愈傷組織顆粒感明顯，呈淺黃色。繼代培養(yǎng)約4周時，愈傷組織增值明顯。繼代兩次后將愈傷組織接種到再分化培養(yǎng)基上進行再分化誘導(dǎo)。再分化培養(yǎng)基為：MS+3 mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+7.5g·L^-1瓊脂，pH=5.8。

（4）試管鱗莖誘導(dǎo)與收獲

在再分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)約7周后，不定芽已經(jīng)長成簇生試管苗，簇生試管苗的高度達到5-8 cm，即可將簇生試管苗移入誘導(dǎo)試管鱗莖培養(yǎng)基，其試管鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 120 g · L^-1 綿白糖 + 6.8 g · L^-1瓊脂， pH=7.5，約6周后，95%的試管苗誘導(dǎo)成試管鱗莖，將成熟的試管鱗莖取出，清洗表層培養(yǎng)基后陰干，放4 ℃冰箱低溫儲存。

（5）試管鱗莖萌發(fā)潛力檢測：

將收獲的試管鱗莖進行縱向解剖，觀察其是否存在儲藏葉，可清晰觀察到儲藏葉的試管鱗莖即具有萌發(fā)潛力，可于田間種植形成再生植株。

本發(fā)明公開的大蒜根尖分生組織再生的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于：

（1）該方法的核心是用大蒜根尖分生組織為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)，再分化出試管苗，試管苗誘導(dǎo)成試管鱗莖。愈傷組織誘導(dǎo)率達97.5%，愈傷組織再生率可達85%，試管鱗莖的誘導(dǎo)率達95%以上。

（2）通過組培途徑誘導(dǎo)發(fā)育的試管鱗莖對環(huán)境適應(yīng)性強，耐貯藏，易成活。本發(fā)明獲得的試管鱗莖均具有儲藏葉，即均具有發(fā)芽的潛力。為大蒜組織培養(yǎng)途徑脫毒快繁提供了新的技術(shù)方法。

（3）本發(fā)明以大蒜根尖分生組織為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)，誘導(dǎo)再生試管苗，試管苗直接誘導(dǎo)成具有萌發(fā)能力的試管鱗莖，避免了試管苗經(jīng)過生根、煉苗、移栽等繁瑣過程，提高了試管苗成活率。同時與通過莖尖組培途徑相比，雖然根尖和莖尖都處于生長點，都有天然脫毒的效果，但每一個大蒜瓣只有一個莖尖，用于愈傷組織誘導(dǎo)的莖尖需要在解剖鏡下剝離，后期的消毒程度對愈傷組織誘導(dǎo)也有一定的影響；而一個大蒜瓣可以發(fā)出幾條或幾十條根，大蒜瓣可以整體消毒后再進行根的誘導(dǎo)萌發(fā)，實驗取材方便，材料量充足。

（4）本發(fā)明構(gòu)建以大蒜根尖分生組織為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)、再分化、試管鱗莖誘導(dǎo)以及試管鱗莖萌發(fā)潛力檢測的完整方法，該方法在國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。

附圖說明

圖1為大蒜水培養(yǎng)生根；

圖2為大蒜根尖誘導(dǎo)愈傷；其中a.大蒜根部接入篩選培養(yǎng)基中，b-e. 大蒜根尖誘導(dǎo)愈傷組織1周、2周、3周、4周的生長狀況培養(yǎng)；

圖3為解剖鏡下觀察大蒜根尖誘導(dǎo)愈傷組織；其中a.大蒜根部接入篩選培養(yǎng)基中，b-e. 大蒜根尖誘導(dǎo)愈傷組織1周、2周、3周、4周的生長狀況培養(yǎng)；

圖4為大蒜根尖愈傷組織再分化及再生試管苗；其中a.愈傷組織接入繼代培養(yǎng)基中b-c.愈傷組織繼代2周、5周d.繼代兩次后接入分化培養(yǎng)基中e-i. 分化培養(yǎng)1周、2周、3周、4周、7周的試管苗再生過程；

圖5為誘導(dǎo)再生苗試管鱗莖；其中a.接入誘導(dǎo)試管鱗莖培養(yǎng)基，b-f. 分別為誘導(dǎo)1周、2周、3周、4周、6周的試管鱗莖；

圖6為試管鱗莖形態(tài)及生長點；a. 試管鱗莖b.試管鱗莖生長點（圖中箭頭所示位置）。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權(quán)利要求來限定。其中本發(fā)明所用到的NAA，KT， 蔗糖，10%安替福民、瓊脂、六瓣紅大蒜均有市售。

實施例1

一種大蒜根尖分生組織再生的方法：

（1）以大蒜根尖分生組織為外植體誘導(dǎo)愈傷組織：

選取沒有病斑的大蒜鱗莖剝?nèi)ネ馄ず笞詠硭疀_洗30 min，然后于紫外滅菌后的超凈工作臺中用0.1%（w/w）的 HgCl₂浸泡20 min，無菌蒸餾水洗滌2次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，無菌蒸餾水洗滌3遍后，將大蒜鱗莖接入無菌培養(yǎng)瓶中生根；待根長至2cm時，切下大蒜根部，用解剖針縱劃，將其接入篩選培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=5.8；

（2）大蒜根尖愈傷組織繼代和再分化：

大蒜根尖愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長4周后，可進行繼代，繼代培養(yǎng)約2周時，愈傷組織顆粒感明顯，呈淺黃色，繼代培養(yǎng)4周時，愈傷組織增值明顯，繼代兩次后進行再分化，繼代培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，再分化培養(yǎng)基為：

MS+3 mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+7.5g·L^-1瓊脂，pH=5.8；

（3）試管鱗莖誘導(dǎo)與收獲

再分化培養(yǎng)1周時愈傷組織表面開始出現(xiàn)大量的綠點，2周可以觀察到綠點不斷生長，逐漸形成不定芽，3周時，大部分綠點形成不定芽，4周不定芽長至約2cm，7周后不定芽生長長至6cm的簇生試管苗，將簇生試管苗移入誘導(dǎo)試管鱗莖培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基為MS + 120 g · L^-1 綿白糖 + 6.8 g · L^-1瓊脂， pH=7.5，試管鱗莖成熟后取出，清洗表層培養(yǎng)基后陰干，放4 ℃冰箱低溫儲存.

實施例2

（1）大蒜根尖分生組織獲得：

選取沒有病斑的寶坻大蒜“六瓣紅”鱗莖，剝?nèi)ネ馄ず笞詠硭疀_洗30 min，然后于紫外滅菌后的超凈工作臺中用0.1%（w/w）的 HgCl₂浸泡20 min，無菌蒸餾水洗滌2-3次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，無菌蒸餾水洗滌3-5遍后，將大蒜鱗莖接入無菌培養(yǎng)瓶中生根；大蒜鱗莖剛接入生根培養(yǎng)瓶中時，基部已經(jīng)生長出0.2-0.3cm的根部（見圖1-a），在水中培養(yǎng)3天后，大蒜根部長至2-3cm（見圖1-b），可接入誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中。

（2）以大蒜根尖分生組織為外植體誘導(dǎo)愈傷組織

待大蒜根部長至2-3cm時，切下大蒜根部，用解剖針縱劃，將其接入篩選培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)，并觀察其誘導(dǎo)情況。

本發(fā)明以MS為基本培養(yǎng)基，通過添加不同激素種類和濃度設(shè)計了16種篩選培養(yǎng)基（見表1），同時附加蔗糖30g·L^-1，瓊脂7.5g·L^-1，pH=5.8，121 ℃ (1.03×10⁵ Pa)滅菌20 min后使用。表1為大蒜根尖誘導(dǎo)愈傷篩選培養(yǎng)基：

表1 篩選培養(yǎng)基激素配比

由于不同激素種類（2，4-D和6-BA）及濃度對不定芽再生效率有一定的影響，我們設(shè)計了16種篩選培養(yǎng)基，將大蒜根部長至2-3cm時接入上述篩選培養(yǎng)基中，每瓶中均接入40條根，以2周時間出愈傷組織條數(shù)/40來計算愈傷組織誘導(dǎo)率，統(tǒng)計愈傷組織形成的誘導(dǎo)率，確定最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，其結(jié)果如下表所示：

表2 不同激素配比對寶坻大蒜根尖誘導(dǎo)形成愈傷組織的影響

從表2可以看出，培養(yǎng)基1到8號中，只有2,4-D，其誘導(dǎo)率較低，而培養(yǎng)基9到16號中，在相同濃度的2,4-D條件下，其誘導(dǎo)率均比1到8號高，說明2，4-D對大蒜根尖的愈傷組織有誘導(dǎo)作用，但是當(dāng)2，4-D與6-BA相互作用時，其誘導(dǎo)率更高。因此，誘導(dǎo)大蒜根尖形成愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為：10號培養(yǎng)基，即：MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=5.8，誘導(dǎo)率達到97.5%。圖1是在最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織各環(huán)節(jié)：剛接入培養(yǎng)基時未見明顯膨大（圖2-a）。經(jīng)過1周左右，大蒜根尖分生組織區(qū)出現(xiàn)膨大現(xiàn)象并變?yōu)闇\褐色（圖2-b）。愈傷組織持續(xù)生長，大約2周后，大蒜根尖分生組織區(qū)持續(xù)膨大并變?yōu)闇\黃色（圖2-c）。3周后，大蒜根尖分生組織區(qū)出現(xiàn)明顯的組織結(jié)構(gòu)，呈淺黃色半透明狀態(tài)（圖2-d）。大約4周后，大蒜根尖分生區(qū)有明顯的塊狀愈傷組織生成（圖2-e）。最終確定出愈率最高的培養(yǎng)基為MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 瓊脂，pH=5.8。圖3展示的解剖鏡下根尖愈傷組織的形成過程：在解剖鏡下觀察大蒜根尖誘導(dǎo)形成愈傷組織過程見圖3，剛接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基時，大蒜根尖無變化。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長1周左右時間，大蒜根尖分生組織區(qū)膨大，為淡黃色（圖3-a）。2周左右時間，分生組織區(qū)持續(xù)膨大，為淺黃色，呈半透明狀態(tài)（圖3-b）。3周后，分生組織區(qū)出現(xiàn)明顯塊狀組織（圖3-d）。4周后，分生組織區(qū)塊狀結(jié)構(gòu)增大，可進行繼代培養(yǎng)（圖3-e）。

（3）大蒜根尖愈傷組織繼代和再分化：

大蒜根尖分生組織區(qū)形成的愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長4周后，可進行繼代（圖4-a）。繼代培養(yǎng)約2周時，愈傷組織顆粒感明顯，呈淺黃色（圖4-b）。繼代培養(yǎng)約4周時，愈傷組織增值明顯（圖4-c）。繼代兩次后，愈傷組織可以進行分化（圖4-d），1周左右時愈傷組織表面開始出現(xiàn)大量的綠點（圖4-e），約2周左右可以觀察到綠點不斷生長，逐漸形成不定芽（圖4-f），3周左右時，大部分綠點形成不定芽（圖4-g），4周左右不定芽長至約2cm（圖4-h），7周后不定芽生長旺盛，約5 cm左右，可用于誘導(dǎo)試管鱗莖（圖4-i）。

（4）試管鱗莖誘導(dǎo)與收獲

在再分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)約7周后，不定芽已經(jīng)長成簇生試管苗，簇生試管苗的高度達到5-8 cm，即可將簇生試管苗移入誘導(dǎo)試管鱗莖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)試管鱗莖的培養(yǎng)基為：MS+120g· L^-1綿白糖+6.8g· L^-1瓊脂，pH=7.5。從圖5中可以看到，誘導(dǎo)大約1周后，試管苗根部開始膨大（圖5-b）；2周后，試管苗出現(xiàn)枯萎（圖5-c）；3周時，鱗莖外表皮逐漸變?yōu)樽仙▓D5-d）；4周時，誘導(dǎo)形成的試管鱗莖大部分外表皮變?yōu)樽仙嚬苊缈菸F(xiàn)象嚴重（圖5-e）；6周后，試管苗枯萎，試管鱗莖基本成熟（圖5-f）。此時，將試管鱗莖從培養(yǎng)瓶中取出，洗去表面培養(yǎng)基，于陰涼處晾干。

（5）試管鱗莖萌發(fā)潛力檢測：

將收獲的試管鱗莖在解剖鏡下縱向剖開，進行解剖觀察，觀察其是否存在儲藏葉，可清晰觀察到儲藏葉的試管鱗莖即具有萌發(fā)潛力。圖6為試管鱗莖縱向解剖圖，可清晰觀察到生長點（圖6-a-b），表明收獲的試管鱗莖可于田間再生出植株，這為后期再生植株在田間正常生長以及性狀觀察奠定了基礎(chǔ)。