本發(fā)明涉及水果蔬菜病害防治技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種灰霉病防治方法。

背景技術(shù)：

灰霉病是露地、保護(hù)地作物常見(jiàn)且比較難防治的一種真菌性病害，屬于低溫高濕型病害，病原菌生長(zhǎng)溫度為20～30℃，因此，溫度在20～25℃、濕度持續(xù)在90％以上時(shí)為病害高發(fā)期。灰霉病發(fā)生在草莓、黃瓜、茄子、番茄、辣椒、葡萄等二十幾種作物中；灰霉病對(duì)作物的莖、葉、花、果以及果梗均能造成危害；灰霉病對(duì)果實(shí)的危害尤為嚴(yán)重。

灰霉病是由半知菌亞門(mén)絲孢目葡萄孢屬真菌中的灰葡萄孢菌引起的，該病不僅是作物常見(jiàn)且比較難防治的一種真菌性病害，并且該病是一種典型的氣傳病害，可隨空氣、水流以及農(nóng)事作業(yè)傳播，通常有一個(gè)發(fā)病中心然后向周?chē)鷶U(kuò)展，發(fā)生后不及時(shí)防治，蔓延較快；灰霉病病苗色淺，葉片、葉柄發(fā)病呈灰白色，水漬狀、組織軟化至腐爛，高濕時(shí)表面生有霉灰；幼莖多在葉柄基部初生不規(guī)則水浸斑，很快變軟腐爛，縊縮或者折倒，最后病苗腐爛枯死；果實(shí)染病時(shí)，青果受害嚴(yán)重，殘留的柱頭或花瓣多被浸染，后向果實(shí)擴(kuò)展，致使果皮呈灰白色，并生有厚厚的灰色霉層，呈水腐狀；灰霉病不僅容易傳染、還可以從作物的幼苗危害到作物的果實(shí)；并且灰霉病病原菌徹底消除的難度極大；因此，只要在作物中一旦爆發(fā)灰霉病，不僅會(huì)造成幼苗的死亡，還會(huì)影響果蔬的產(chǎn)量和品質(zhì)；會(huì)對(duì)作物造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。

因此，現(xiàn)在在種植作物的過(guò)程中，對(duì)灰霉病的防治就顯得尤為重要。目前化學(xué)防治是防治灰霉病最為普遍和廣泛的方法；化學(xué)防治是通過(guò)采用化學(xué)藥劑對(duì)灰霉病進(jìn)行防治的方法；目前采用的化學(xué)藥劑主要為嘧啶胺類(lèi)殺菌劑、吡咯類(lèi)殺菌劑以及酰胺類(lèi)殺菌劑等幾類(lèi)殺菌劑。化學(xué)防治的主要優(yōu)點(diǎn)，在對(duì)于灰霉病致病菌的殺傷力效果顯著、迅速且穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)、防治工作操作簡(jiǎn)單、工作量小；但是化學(xué)藥劑長(zhǎng)期的使用，使得灰霉病的致病菌的抗藥性不斷的增強(qiáng)，抗藥性強(qiáng)的菌株增多，實(shí)際上導(dǎo)致化學(xué)防治的效果大大下降；另外，上述幾類(lèi)殺菌劑都是劇毒型藥品，化學(xué)藥劑在殺菌的之后，化學(xué)藥劑的殘留弊端越來(lái)越凸顯；一方面是化學(xué)藥劑極易在作物中大量殘留，導(dǎo)致人們最后食用的果蔬中殘留的有毒物質(zhì)超標(biāo)，長(zhǎng)期食用對(duì)人們的身體造成極大的傷害；已經(jīng)滿(mǎn)足不了人們向往安全、低毒作用果蔬的購(gòu)買(mǎi)需求；另一方面是大量的化學(xué)藥品在土壤中無(wú)法分解，導(dǎo)致土壤的質(zhì)地變化，給環(huán)境帶來(lái)了巨大的危害性壓力；因此，灰霉病的化學(xué)防治的優(yōu)勢(shì)不斷減少。

現(xiàn)在逐漸開(kāi)始研究采用生物防治的手段來(lái)防止灰霉病，目前研究了木霉、酵母菌、芽孢桿菌對(duì)灰霉病的生物防治具有一定的效果；但是目前光合細(xì)菌在灰霉病的生物防治中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，現(xiàn)在將光合細(xì)用于灰霉病的生物防治，實(shí)現(xiàn)對(duì)灰霉病病原菌殺傷力效果顯著、迅速，效果穩(wěn)定并且對(duì)灰霉病防治過(guò)程無(wú)毒，避免在灰霉病防治過(guò)程中在作物中殘留大量有毒物質(zhì)是我們研究的方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：怎樣提供一種灰霉病防治方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)灰霉病病原菌殺傷力效果顯著、迅速、效果穩(wěn)定，并且實(shí)現(xiàn)灰霉病的防治過(guò)程無(wú)毒，避免在作物上殘留大量的有毒物質(zhì)，滿(mǎn)足人們對(duì)低毒果蔬的需求。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：

一種灰霉病防治方法，其特征在于，采用噴施光合細(xì)菌的方式，通過(guò)光合細(xì)菌抑制灰霉病病原菌的菌絲生長(zhǎng)和對(duì)灰霉病病原菌菌絲體進(jìn)行致畸作用導(dǎo)致病原菌孢子無(wú)法形成，以實(shí)現(xiàn)對(duì)灰霉病的防治。

進(jìn)一步地，所述光合細(xì)菌為類(lèi)腸球菌、深紅紅螺菌或者沼澤紅假單胞菌的一種。

進(jìn)一步地，所述光合細(xì)菌為沼澤紅假單胞菌；沼澤紅假單胞菌不僅對(duì)灰霉病病原菌菌絲的生長(zhǎng)具有很好的抑制作用，而且對(duì)灰霉病病原菌菌絲體具有致畸作用，使得灰霉病病原菌菌絲體無(wú)法形成孢子；使得噴施沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液后，第2天的抑菌率就達(dá)到71.17％，與噴施化學(xué)藥劑防治灰霉病，第2天達(dá)到的抑菌率71.17％相同。在第4天之后，沼澤紅假單胞菌對(duì)灰霉病病原菌的抑菌率一直穩(wěn)定在87.29％；而化學(xué)藥劑對(duì)灰霉病病原菌的抑菌率在第4天達(dá)到最高為81.22％，從第4天開(kāi)始，抑菌率下降到67.30％。因此，沼澤紅假單胞菌對(duì)灰霉病的防治效果更加顯著、迅速并且防治效果更加穩(wěn)定。

進(jìn)一步地，所述噴施光合細(xì)菌的方式是指將光合細(xì)菌制備成發(fā)酵液，定期將制備好的光和細(xì)菌發(fā)酵液均勻噴施在作物上，可以在作物上間隔24h-72h定期在作物上噴施光合細(xì)菌發(fā)酵液，對(duì)灰霉病的防治效果最好。

進(jìn)一步地，所述光合細(xì)菌發(fā)酵液按照以下方式制備，光合細(xì)菌接種在固體培養(yǎng)基中，在7500lx的光照強(qiáng)度下、30℃光照培養(yǎng)箱中恒溫光照培養(yǎng)7～14d，觀察培養(yǎng)基中長(zhǎng)出紅色或褐紅色單菌落，用接種環(huán)挑取單菌落接入到光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度為7500lx、溫度為30℃的光照恒溫箱中擴(kuò)大培養(yǎng)至14d左右得到光合細(xì)菌發(fā)酵液，無(wú)菌條件下將光合細(xì)菌發(fā)酵液轉(zhuǎn)入滅菌的噴霧器中，保存在4℃的冰箱中備用。

進(jìn)一步地，所述灰霉病是指發(fā)生在草莓果實(shí)上的灰霉病。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了光合細(xì)菌對(duì)灰霉病的病原菌灰葡萄孢菌的菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用、對(duì)灰葡萄孢菌的菌絲體具有致畸作用以及使得灰葡萄孢菌的孢子無(wú)法形成的作用；實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，光合細(xì)菌對(duì)灰霉病具有防治作用，提供了一種有效的灰霉病生物防治方法；實(shí)現(xiàn)了灰霉病防治過(guò)程無(wú)毒，避免在果蔬中殘留大量有毒物質(zhì)，滿(mǎn)足了人們對(duì)低毒果蔬的需求。

(2)本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證類(lèi)腸球菌1.2176、深紅紅螺菌1.5005或者沼澤紅假單胞菌1.8929均對(duì)灰霉病的病原菌灰葡萄孢菌具有抑菌作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，類(lèi)腸球菌1.2176的最高抑菌率可以達(dá)到70.42％，深紅紅螺菌1.5005的最高抑菌率可以達(dá)到61.36％，沼澤紅假單胞菌1.8929的最高抑菌率可以達(dá)到87.29％；證明了光合細(xì)菌不但對(duì)灰霉病病原菌灰葡萄孢菌具有抑菌作用，并且抑菌效率達(dá)到61.36％以上，最高的抑菌率可以達(dá)到87.29％，說(shuō)明光合細(xì)菌對(duì)灰霉病的防治具有良好的效果。

(3)本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，沼澤紅假單胞菌1.8929第二天對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率就達(dá)到71.17％，第四天的抑菌率達(dá)到最高，抑菌率為87.29％，第五天、第六天的抑菌率穩(wěn)定在87.29％；現(xiàn)有的酰胺類(lèi)殺菌劑的最高抑菌率為81.22％，但是在第四天抑菌率出現(xiàn)明顯下降；因此，證明了沼澤紅假單胞菌1.8929對(duì)化學(xué)藥劑對(duì)灰葡萄孢菌的防治效率更顯著，對(duì)灰葡萄孢菌的殺傷力更強(qiáng)，防止效果更加穩(wěn)定，并且與化學(xué)防治方法相比，采用光合細(xì)菌對(duì)灰霉病進(jìn)行防治的過(guò)程無(wú)毒，不僅避免了對(duì)工人身體造成危害，也從根本上避免了果蔬內(nèi)殘留大量有毒物質(zhì)的情況發(fā)生，可以實(shí)現(xiàn)低毒果蔬的生產(chǎn)，滿(mǎn)足了人們對(duì)低毒果蔬的需求。

(4)本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，類(lèi)腸球菌1.2176發(fā)酵液處理之后的灰葡萄孢菌菌絲體較為聚集，分支數(shù)量也增加，少數(shù)菌絲出現(xiàn)褶皺現(xiàn)象，灰葡萄孢菌的孢子形成數(shù)量減少；深紅紅螺菌1.5005的分支增多，灰葡萄孢菌的孢子形成基本無(wú)影響；沼澤紅假單胞菌1.8929發(fā)酵液處理之后的灰葡萄孢菌菌絲體粗短、數(shù)量減少、分支增多、菌絲褶皺現(xiàn)象嚴(yán)重，且無(wú)法形成孢子；因此，本發(fā)明不僅能夠抑制灰葡萄孢菌的正常生長(zhǎng)，還能夠使得灰葡萄孢菌菌絲體的生長(zhǎng)形態(tài)，還影響孢子的形成，實(shí)現(xiàn)了從根本上解決了灰霉病的防治問(wèn)題。

綜上所述，本發(fā)明能夠?qū)颐共母旧线M(jìn)行防治，使得對(duì)灰霉病的防治效果顯著、防治效果穩(wěn)定、整個(gè)灰霉病防治過(guò)程無(wú)毒以及防治成本低等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中放置沾取有無(wú)菌水濾紙片的pda培養(yǎng)基中灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)實(shí)物圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中放置沾取有深紅紅螺菌1.5005發(fā)酵液濾紙片的pda培養(yǎng)基中灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)實(shí)物圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中放置沾取有沼澤紅假單胞菌1.8929發(fā)酵液濾紙片的pda培養(yǎng)基中灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)實(shí)物圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中放置沾取有類(lèi)腸球菌1.2176發(fā)酵液濾紙片的pda培養(yǎng)基中灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)實(shí)物圖。

圖5為實(shí)施例4中灰葡萄孢菌菌餅第4d在無(wú)菌水與pda培養(yǎng)基制成的混合培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)實(shí)物圖。

圖6為實(shí)施例4中灰葡萄孢菌菌餅第4d在深紅紅螺菌1.5005發(fā)酵液與pda培養(yǎng)基制成的混合培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)實(shí)物圖。

圖7為實(shí)施例4中灰葡萄孢菌菌餅第4d在沼澤紅假單胞菌1.8929發(fā)酵液與pda培養(yǎng)基制成的混合培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)實(shí)物圖。

圖8為實(shí)施例4中灰葡萄孢菌菌餅第4d在類(lèi)腸球菌1.2176發(fā)酵液與pda培養(yǎng)基制成的混合培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)實(shí)物圖。

圖9為實(shí)施例4中灰葡萄孢菌菌餅第4d在1000倍稀釋度酰胺·嘧霉溶液的與pda培養(yǎng)基制成的混合培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)實(shí)物圖。

圖10為實(shí)施例4中灰葡萄孢菌菌餅第4d在1500倍稀釋度酰胺·嘧霉溶液與pda培養(yǎng)基制成的混合培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)實(shí)物圖。

圖11為圖5中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌的菌絲在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖12為圖6中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌的菌絲在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖13為圖7中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌的菌絲在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖14為圖8中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌的菌絲在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖15為圖9中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌的菌絲在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖16為圖10中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌的菌絲在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖17為圖5中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌產(chǎn)生孢子在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖18為圖6中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌產(chǎn)生孢子在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖19為圖7中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌產(chǎn)生孢子在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖20為圖8中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌產(chǎn)生孢子在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖21為圖9中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌產(chǎn)生孢子在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖22為圖10中培養(yǎng)的灰葡萄孢菌產(chǎn)生孢子在電子顯微鏡下的生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。本實(shí)施案例在以本發(fā)明技術(shù)為前提下進(jìn)行實(shí)施，現(xiàn)給出詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程來(lái)說(shuō)明本發(fā)明具有創(chuàng)造性，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于以下的實(shí)施例。

實(shí)施例1光合細(xì)菌菌株及培養(yǎng)

類(lèi)腸球菌，編號(hào)：1.2176，購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。類(lèi)腸球菌培養(yǎng)基(由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供)的配方如下：

類(lèi)腸球菌培養(yǎng)基(成分及終濃度)：磷酸二氫鉀1.0g，氯化鈣0.1g，碳酸氫鈉3.0g，乙酸鈉1.0g，氯化鎂0.5g，氯化銨1.0g，氯化鈉1.0g，琥珀酸鈉1.0g，酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，微量元素溶液1.0ml，維生素溶液1.0ml，蒸餾水定容至1000ml，ph調(diào)至6.8。

深紅紅螺菌，編號(hào)：1.5005，購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。深紅紅螺菌培養(yǎng)基(由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供)的配方如下：

深紅紅螺菌培養(yǎng)基(成分及終濃度)：酵母提取物2.00g，胰酶解酪蛋白胨2.00g，磷酸二氫鉀0.30g，磷酸氫二鉀0.30g，硫酸銨0.30g，氯化鈉0.60g，七水合硫酸鎂0.13g，七水合硫酸亞鐵2.00mg，二水合氯化鈣8.00mg，乙酸鈉2.50g，甲酸鈉2.50g，碳酸氫鈉5.00g，l-半胱氨酸0.50g，九水合硫化鈉0.50g，刃天青1.00mg，微量鹽溶液10.00ml，維生素溶液10.00ml，蒸餾水定容至1000ml，自然ph。

沼澤紅假單胞菌，編號(hào)：1.8929，購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基(由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供)的配方如下：

沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基(成分及終濃度)：葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，示蛋白胨0.5g，酵母浸膏0.5g，酸水解酪素0.5g，丙酮酸鈉0.3g，磷酸氫二鉀0.3g，七水合硫酸鎂0.05g，瓊脂15g，蒸餾水定容至1000ml，ph調(diào)至7.2。

其中，微量元素溶液：四水合氯化亞鐵1.8g，六水合氯化鈷0.25g，六水合氯化鎳0.01g，二水合氯化銅0.01g，四水合氯化錳0.70g，氯化鋅0.1g，硼酸0.5g，二水合鉬酸鈉0.03g，五水合亞硒酸鈉0.01g，蒸餾水定容至1000ml。

維生素溶液：生物素0.1g，煙酸0.35g，鹽酸硫胺素0.3g，對(duì)氨基苯甲酸0.2g，鹽酸吡多胺0.1g，泛酸鈣0.1g，維生素b120.05g，蒸餾水定容至1000ml。

實(shí)施例2光合細(xì)菌發(fā)酵液的制備

將類(lèi)腸球菌1.2176、深紅紅螺菌1.5005和沼澤紅假單胞菌1.8929分別接種在三個(gè)固體培養(yǎng)基(固定培養(yǎng)基的成分)中，將三個(gè)固定培養(yǎng)基在7500lx的光照強(qiáng)度下、30℃光照培養(yǎng)箱中恒溫光照培養(yǎng)7～14d，分別觀察三個(gè)培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的紅色或褐紅色單菌落，用接種環(huán)分別挑取三個(gè)固體培養(yǎng)基中的單菌落分別對(duì)應(yīng)接入到類(lèi)腸球菌培養(yǎng)基、深紅紅螺菌培養(yǎng)基、沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度為7500lx、溫度為30℃的光照恒溫箱中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至14d左右分別得到類(lèi)腸球菌發(fā)酵液、深紅紅螺菌發(fā)酵液以及沼澤紅假單孢菌發(fā)酵液，在無(wú)菌條件下分別將類(lèi)腸球菌發(fā)酵液、深紅紅螺菌發(fā)酵液以及沼澤紅假單孢菌發(fā)酵液轉(zhuǎn)入滅菌的噴霧器中，保存在4℃的冰箱中備用。

實(shí)施例3光合細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)灰霉病病原菌灰葡萄孢菌拮抗活性的初步測(cè)定

a、灰霉菌病原菌：灰葡萄孢菌(北華大學(xué)林學(xué)院分離保存)。

灰葡萄孢菌的活化培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備。將保存在斜面培養(yǎng)基的灰葡萄孢轉(zhuǎn)入pda培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7～14d活化，將活化的灰葡萄孢接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7天長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基中后，于25℃恒溫條件下光照處理48h后，加入無(wú)菌水，使得無(wú)菌水能夠剛好將菌落的表面進(jìn)行覆蓋；在同等條件繼續(xù)處理24～48h至產(chǎn)生大量孢子囊，釋放孢子，制成孢子懸浮液。

其中pda培養(yǎng)基(成分及終濃度)：去皮馬鈴薯200g，沸水浴20min，用雙層紗布過(guò)濾，葡萄糖20.0g，瓊脂粉18g-20g，溶化后，用蒸餾水定容至1000ml，自然ph。

b、酰胺·嘧霉藥劑的配制。根據(jù)酰胺·嘧霉使用技術(shù)和使用方法指導(dǎo)，分別制備1000倍及1500倍稀釋度的酰胺·嘧霉溶液。

c、光合細(xì)菌對(duì)灰葡萄孢菌拮抗活性的初步測(cè)定。采用濾紙片法，以濾紙片上沾取無(wú)菌水放置在涂布有灰葡萄孢菌懸浮液的pda培養(yǎng)基上為空白對(duì)照組ck，將分別沾取類(lèi)深紅紅螺菌1.5005發(fā)酵液、沼澤紅假單胞菌1.8929發(fā)酵液和類(lèi)腸球菌1.2176發(fā)酵液的圓孔濾紙片分別放置在涂布有灰葡萄孢菌懸浮液的1號(hào)pda培養(yǎng)基、2號(hào)pda培養(yǎng)基和3號(hào)pda培養(yǎng)基上，進(jìn)行四次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

接種后每24小時(shí)進(jìn)行觀察，得到圖1-4，圖1-4是接種后第4天拍的照片，從圖1-4中可以看出，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組ck中，pda培養(yǎng)基中灰葡萄孢菌正常生長(zhǎng)，菌落生長(zhǎng)密集，菌落生長(zhǎng)顏色較深；1號(hào)pda培養(yǎng)基中，灰葡萄孢菌生長(zhǎng)較為正常，菌落生長(zhǎng)的密集程度比空白對(duì)照組ck的密集程度低，菌落顏色較淺；2號(hào)pda培養(yǎng)基中，在接種沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的濾紙片周?chē)纬梢粋€(gè)沒(méi)有任何菌株生長(zhǎng)的透明抑菌圈，抑菌圈邊界明顯，抑菌圈寬而透明；3號(hào)pda培養(yǎng)基中，在接種類(lèi)腸球菌發(fā)酵液的濾紙片周?chē)贁?shù)形成抑菌圈，多數(shù)不形成抑菌圈，并且形成的抑菌圈比2號(hào)pda培養(yǎng)基中形成的抑菌圈較窄，抑菌圈邊界不明顯。

實(shí)施例4光合細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)灰霉病病原菌灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響

將深紅紅螺菌1.5005發(fā)酵液、沼澤紅假單胞菌1.8929發(fā)酵液和類(lèi)腸球菌1.2176發(fā)酵液分別與溶化后的pda培養(yǎng)基按照體積1：1的比例混合制成1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)混合pda培養(yǎng)基，混合pda培養(yǎng)基的總體積為40ml；加入等量的無(wú)菌水與pda培養(yǎng)基混合制成陰性對(duì)照組ck，以加入等量1000倍、1500倍稀釋度的酰胺·嘧霉溶液分別與pda培養(yǎng)基混合制成陽(yáng)性對(duì)照組ck1及ck2。

將培養(yǎng)6d的灰葡萄孢菌制成直徑為6mm的菌餅，在1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)混合pda培養(yǎng)基、陰性對(duì)照組ck、陽(yáng)性對(duì)照組ck1及ck2中分別接種3個(gè)制作的灰葡萄孢菌菌餅，三個(gè)菌餅呈三角形接種在培養(yǎng)基中；然后將全部培養(yǎng)基置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，進(jìn)行四次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。第4d觀察灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)情況得到圖5-10，并記錄菌落直徑，并計(jì)算菌絲抑制率：

抑制率(％)＝(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100

通過(guò)上述計(jì)算公式得到1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)pda培養(yǎng)基、陽(yáng)性對(duì)照組ck1及ck2中的灰葡萄孢菌的菌絲抑制率得到表1。

通過(guò)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察：陰性對(duì)照組ck中灰葡萄孢菌正常生長(zhǎng)，第二天開(kāi)始出現(xiàn)白色菌絲，第四天時(shí)，菌絲布滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)基；沼澤紅假單胞菌1.8929對(duì)灰葡萄孢菌有明顯抑制作用，自產(chǎn)生抑菌圈后，灰葡萄孢菌菌絲不再繼續(xù)擴(kuò)散，抑菌率不斷上升，4d開(kāi)始達(dá)到最高為87.29％；類(lèi)腸球菌1.2176的養(yǎng)基中產(chǎn)生抑菌圈，灰葡萄孢菌菌絲不再繼續(xù)擴(kuò)散，而對(duì)于大多數(shù)未產(chǎn)生抑菌圈的培養(yǎng)皿中，灰葡萄孢菌菌絲則繼續(xù)擴(kuò)散，可見(jiàn)類(lèi)腸球菌1.2176對(duì)灰葡萄孢菌抑制作用不夠穩(wěn)定，抑制率在第3d達(dá)到最高值為70.72％；在接種初期，深紅紅螺菌1.5005對(duì)灰葡萄孢菌有抑制作用，抑制率在第3d達(dá)到最高值為61.36％，接種后期無(wú)明顯抑制作用，灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)幾乎和空白對(duì)照組相似；加入等量1000倍稀釋度酰胺·嘧霉溶液的pda培養(yǎng)基對(duì)灰葡萄孢菌有明顯抑制作用，第3d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)灰葡萄孢菌菌絲，并且生長(zhǎng)緩慢，抑制率達(dá)到81.22％，于5d開(kāi)始灰葡萄孢菌菌絲不再生長(zhǎng)；加入等量1500倍稀釋度酰胺·嘧霉溶液的pda培養(yǎng)基對(duì)灰葡萄孢菌有較好的抑制作用，第3d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)灰葡萄孢菌菌絲，并且生長(zhǎng)緩慢，抑制率最高值可達(dá)到74.72％。

實(shí)施例5光合細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)灰霉病病原菌灰葡萄孢菌菌絲體的致畸作用及孢子形成影響

將實(shí)施例4中1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)混合pda培養(yǎng)基中、陰性對(duì)照組ck、陽(yáng)性對(duì)照組ck1及ck2培養(yǎng)的灰葡萄孢菌菌絲通過(guò)電子顯微鏡進(jìn)行觀察及對(duì)比得到圖11-16和圖17-22。

從圖11-16和圖17-22中可以看出，陰性對(duì)照組ck中的灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)健壯，正常生長(zhǎng)，原生質(zhì)均勻、隔膜明顯、萌發(fā)的孢子數(shù)量多；2號(hào)混合pda培養(yǎng)基中的灰葡萄孢菌菌絲的分支增多，萌發(fā)的孢子數(shù)量多；3號(hào)混合pda培養(yǎng)基中葡萄孢菌菌絲體粗短、數(shù)量減少、分支增多、菌絲褶皺現(xiàn)象嚴(yán)重，沒(méi)有孢子形成；4號(hào)合pda培養(yǎng)基中葡萄孢菌較為聚集，分支數(shù)量增加，少數(shù)菌絲出現(xiàn)褶皺現(xiàn)象，孢子萌發(fā)數(shù)量多；陽(yáng)性對(duì)照組ck1及ck2中的灰葡萄孢菌菌絲體的分支明顯增多、斷裂嚴(yán)重、菌絲體變細(xì)，有一定數(shù)量的孢子萌發(fā)。

從上述的圖中和表1中的數(shù)據(jù)可以分析得出：(1)類(lèi)腸球菌1.2176、深紅紅螺菌1.5005、這三種光合細(xì)菌對(duì)灰霉病的病原菌灰葡萄孢菌均有一定的抑菌作用；因此，說(shuō)明光合細(xì)菌對(duì)果蔬中發(fā)生的灰霉病具有一定的防治作用；(2)從圖和表中可以看出，由于沼澤紅假單胞菌1.8929對(duì)灰葡萄孢菌的菌絲體具有致畸作用并使得孢子無(wú)法形成；使得沼澤紅假單胞菌1.8929對(duì)灰霉病病原菌灰葡萄孢菌的抑菌效果在六天以上仍然穩(wěn)定有效，并且第二天沼澤紅假單胞菌1.8929的抑菌率可以達(dá)到71.17％，與化學(xué)藥劑的第一天的抑菌效果相同；另外，第四天沼澤紅假單胞菌1.8929的抑菌率達(dá)到最大87.29％，并且之后的抑菌率一直保持在87.29％；這就說(shuō)明沼澤紅假單胞菌1.8929對(duì)灰葡萄孢菌的殺傷力強(qiáng)，抑菌效果迅速，并且抑菌效果穩(wěn)定，抑菌有效時(shí)間長(zhǎng)；(3)從表中可以分析得到，化學(xué)藥劑用于抑菌的過(guò)程中，在第三天的抑菌率最高，但是化學(xué)藥劑的最高抑菌率還是低于沼澤紅假單胞菌1.8929對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率；說(shuō)明沼澤紅假單胞菌1.8929對(duì)灰霉病的防治效果比化學(xué)藥劑對(duì)灰霉病的防治效果好；并且在第四天時(shí)，ck1及ck2中的抑菌率就出現(xiàn)下降的情況，最后ck1及ck2的抑菌率穩(wěn)定在67.30％和55.72％，而沼澤紅假單胞菌1.8929的抑菌率從第三天后一直為87.29％；說(shuō)明沼澤紅假單胞菌1.8929的抑菌效果更持久穩(wěn)定，并且對(duì)灰霉病的防治更加有效。

實(shí)施例6沼澤紅假單胞菌1.8929對(duì)草莓灰霉病的田間防治效果評(píng)價(jià)

(一)試驗(yàn)方法

四季草莓經(jīng)過(guò)播種、假植、定植30天后，做為田間防效測(cè)定的試驗(yàn)田地。將試驗(yàn)田分成15個(gè)樣方，每個(gè)樣方為長(zhǎng)4米×寬1.5米的矩形，在試驗(yàn)處理工作前48h，每個(gè)樣方按照等距取樣法取10個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)調(diào)查三株，調(diào)查記錄所有草莓果實(shí)的發(fā)病果數(shù)以及所對(duì)應(yīng)的嚴(yán)重程度，按照草莓灰霉病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算每個(gè)樣方的發(fā)病率以及病情指數(shù)。之后每個(gè)樣方噴施灰葡萄孢菌，再做如下五組處理：

a組處理為噴霧法噴施沼澤紅假單胞菌1.8929菌株發(fā)酵液10ml/m²；

b組處理為噴霧法噴施沼澤紅假單胞菌1.8929菌株發(fā)酵液7.5ml/m²；

c組處理為噴霧法噴施沼澤紅假單胞菌1.8929菌株發(fā)酵液5ml/m²；

d組噴施稀釋1000倍的酰胺·嘧霉可濕性干粉劑為陽(yáng)性對(duì)照組ck+；

e組清水處理為陰性對(duì)照組ck-。

用噴霧器將各組處理液噴施到草莓果實(shí)上，每組處理隨機(jī)抽取三個(gè)樣方，做為三次重復(fù)試驗(yàn)。

(二)記錄并計(jì)算結(jié)果

每隔48h噴施各組處理液，并調(diào)查記錄病果數(shù)及其嚴(yán)重程度，共調(diào)查四次(每個(gè)樣方按照等距取樣法取10個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)統(tǒng)計(jì)三株草莓果實(shí))，計(jì)算每一次記錄的發(fā)病率、病情指數(shù)以及防治效果。在整個(gè)試驗(yàn)期間除不噴施任何殺菌劑外，其他田間管理一切照常進(jìn)行。

草莓灰霉病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(以果實(shí)為單位)：

0級(jí)：果實(shí)無(wú)病斑；

1級(jí)：果實(shí)出現(xiàn)零星小病斑；

2級(jí)：病斑面積占總面積的15％及以下；

3級(jí)：病斑面積占總體面積的16％-30％；

4級(jí)：病斑面積占總體面積的30％-50％；

5級(jí)：病斑面積占總體面積的50％以上；

發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果計(jì)算公式如下：

發(fā)病率：是指所調(diào)查的數(shù)據(jù)中，發(fā)病草莓果實(shí)數(shù)占調(diào)查草莓果實(shí)總數(shù)的百分比。

發(fā)病率(％)＝(調(diào)查病果數(shù))/(調(diào)查總果數(shù))×100

病情指數(shù)：是指首先根據(jù)病害發(fā)生的輕重，進(jìn)行分級(jí)記數(shù)調(diào)查，然后根據(jù)所記錄的各病級(jí)的病果數(shù)值按照下列公式進(jìn)行計(jì)算。通過(guò)病情指數(shù)的計(jì)算，可以兼顧病害的普遍性和嚴(yán)重程度。

病情指數(shù)(％)＝∑[病級(jí)果數(shù)×該級(jí)代表數(shù)值]/(調(diào)查總果數(shù)×發(fā)病最高一級(jí)的代表數(shù)值)×100

式中，ck0為對(duì)照防治前葉片的病情指數(shù)，ckn為對(duì)照防治后葉片的病情指數(shù)；pt0為藥劑處理防治前葉片的病情指數(shù)，pt為藥劑處理防治后葉片的病情指數(shù)。

依據(jù)試驗(yàn)方案對(duì)田間草莓進(jìn)行接種處理，調(diào)查并記錄草莓灰霉病病株發(fā)病等級(jí)及所對(duì)應(yīng)株數(shù)，按照公式計(jì)算各處理所得發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果得到表2。

表2為沼澤紅假單胞菌對(duì)草莓灰霉病的防治效果

(spss方差分析，p＝0.05)

從上表中可以分析得出：(1)與空白對(duì)照組相比，使用沼澤紅假單胞菌1.8929菌株發(fā)酵液，草莓的發(fā)病率和病情指數(shù)均降低。(2)沼澤紅假單胞菌1.8929對(duì)草莓果實(shí)上發(fā)生的灰霉病具有良好的防治效果，可以達(dá)到與使用化學(xué)藥劑的防治效果相同；通過(guò)實(shí)現(xiàn)證明，沼澤紅假單胞菌1.8929的防治效果最高達(dá)到41.93％。(4)沼澤紅假單胞菌1.8929菌株發(fā)酵液7.5ml/m²時(shí)，對(duì)草莓果實(shí)上發(fā)生的灰霉病防治效果最好。