本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法。

背景技術：

1、腦卒中又稱中風或腦血管意外，是嚴重威脅人類健康的常見病和多發病。腦卒中分為缺血和出血性，其中缺血性腦卒中是臨床上最常見的腦卒中類型(發病率占8成左右)，它主要是由血液中的各種栓子(如心臟內的附壁血栓、動脈粥樣硬化的斑塊等)隨血流進入腦動脈而阻塞血管，引起該動脈供血區腦組織缺血性壞死，進而出現局灶性的神經功能缺損2。

2、目前缺血性腦卒中的治療方法主要是藥物溶栓。重組組織型纖溶酶原激活物(recombinant?tissue-type?plasminogen?activator,rtpa)是目前唯一被fda批準用于缺血性腦卒中的溶栓藥物，但其有效治療窗狹窄，僅有3.5-4.5h，超過這一時間使用溶栓藥物極易引發腦出血從而危及生命3。

3、通過動物模型模擬腦卒中發病特征，進行治療藥物研發或發病機制研究是目前主要的研究方式。使用線栓阻塞中動脈(middle?cerebral?artery?occlusion,mcao)是最為常用的腦卒中動物模型。該方法形成的缺血性腦卒中梗死體積穩定，動物表現出明顯的神經功能障礙，但是該模型中不涉及血栓的形成，因此不適合進行藥物溶栓相關的研究。

4、適合于藥物溶栓研究的臨床前動物模型種類非常有限。其中最常用的造模方法是通過使用自體血液在體外制造血栓，再通過導管重新注入小鼠腦中動脈的方式。但這種方式對手術技術要求極高，步驟復雜，且造模成功率不高4。除上述方法外，還有通過在頸總動脈進行低頻直流電擊制造血栓，再通過機械粉碎的方式使碎栓在血流的沖擊下進入中動脈供血區實現梗塞。該方法對手術技術要求仍舊較高，且無法精確控制碎栓堵塞的位置，因而模型的穩定性相對較差5。

5、光化學誘導小鼠腦缺血模型是通過靜脈注射光敏物質并利用其在綠色激光下產生自由基，直接損傷血管內皮細胞，使其產生脂質過氧化物，促使血小板聚集,激活凝血過程，在血管損傷之處原位形成血栓，阻塞血管導致缺血。該模型最早是由watson等人于1985年時創立6。該模型對于實驗動物創傷小，造模成功率高，因此廣泛應用于永久性腦梗死及相關研究中。但是該模型自創立之初便以能夠堵塞中動脈(middle?cerebral?artery,mca)的供血區作為目標，并未考慮能否使用rtpa等藥物進行腦缺血-再灌注損傷以及溶栓藥物相關的研究。此外，該模型使用散射激光照射顱骨表面，形成的梗死局限于照射位置的大腦皮層淺表面。因此該類模型的神經功能損傷十分輕微，無法使用常見的神經功能評分去評估動物的神經功能。因此，進一步開發、改進現有的臨床前腦卒中動物模型，對腦卒中的治療研究具有重要意義。

6、在光化學誘導法制造腦卒中動物模型建立的后續的幾十年中，陸續出現了一些基于該模型的改進方法。sugimori7等人在2004年，在小鼠眼睛與耳內緣中線做手術切口，通過使用凸透鏡使激光聚焦照射更接近mca近心端，同時結合照射同側頸總動脈結扎，制造了梗死體積更穩定的光誘導腦中動脈栓塞模型。但是該模型的梗死體積仍舊較小，梗死位置幾乎完全集中在皮層區域，未能影響海馬等腦區，神經功能損傷不明顯。此外，在該研究中仍未進行使用rtpa等藥物進行腦缺血-再灌注損傷以及溶栓藥物相關的研究。

7、sun8等在2020年發現對上述模型注射rtpa并不能很好的發揮溶栓作用，而且灌注水平很低。因而采用了在注射光敏劑—孟加拉紅的同時注射凝血酶的方式，加上低功率、長時間的激光照射，制造出對rtpa更為敏感的光誘導血栓。該方法制造的光誘導腦卒中模型能夠進行溶栓研究，但是造模時同樣需要結扎頸總動脈，且梗死體積仍舊很小(小于20％)，梗死位置仍舊主要集中在皮層區域，神經功能損傷不明顯，因而在應用上仍有較大局限性。

技術實現思路

1、為了解決現有技術中，光化學誘導法制造的腦卒中動物模型梗死體積小、神經功能缺損不明顯，對溶栓藥物響應差的問題，本發明提供了一種光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法。

2、該光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法包括以下步驟：

3、s1：誘導麻醉小鼠，并保障所述小鼠持續處于麻醉狀態，監測所述小鼠肛溫并加熱保持37±0.5℃；

4、s2：所述小鼠側臥位，對一側面部脫毛、消毒，從所述小鼠面部切口，暴露所述小鼠大腦中動脈m3段近心端位置，或大腦中動脈分支血管反向延長線的交叉點；

5、s3：給所述小鼠注射光敏劑，待所述光敏劑在所述小鼠體內循環均勻，激光聚焦后照射所述大腦中動脈m3段近心端或大腦中動脈分支血管反向延長線的交叉點；

6、s4：激光照射結束后，縫合皮膚，停止麻醉，所述小鼠傷口涂布鎮痛藥。

7、進一步地，s2包括以下步驟：

8、在所述小鼠外眼角至耳內緣做第一切口，鈍性分離皮膚至可見顱骨邊緣與面部骨骼肌的分界線，使用顯微剪沿顱骨頭面部分界線剪開肌肉，做第二切口，暴露肌肉下面的上頜骨，沿所述第二切口中線位置垂直做第三切口，分離上下兩側肌肉，充分暴露上頜骨和顳下頜關節，確認所述大腦中動脈m3段近心端位置，或大腦中動脈分支血管反向延長線的交叉點。

9、進一步地，所述第二切口的長度為0.3cm。

10、進一步地，步驟s3中所述光敏劑為孟加拉紅，劑量為50mg/kg。

11、進一步地，照射激光的波長為520nm，功率為40mw，照射時間為3分鐘。

12、進一步地，所述激光光斑直徑為0.7mm。

13、進一步地，激光聚焦過程中可采用10-20mw頻率的激光進行光斑大小及照射位置的調整。

14、有益效果：

15、1.通過本發明提供的光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法獲得的模型的梗死體積更大，梗死侵入皮層下腦區，因而缺血腦組織的病理特征更為明顯。

16、2通過本發明提供的光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法造成的小鼠神經功能障礙更為明顯，適合進行神經功能與運動功能相關的研究工作。

17、3.本發明提供的光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法侵入性小，僅需要面部切口，不需要頸部切口與頸總動脈的結扎，因此腦組織的缺血完全是由血栓阻塞造成，與臨床情況更為相似。

18、4.通過本發明提供的光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法獲得的模型可以在不需要額外注射其他試劑的情況下實現溶栓，因此與臨床情況更為相似，模型操作也更為簡便。

技術特征：

1.一種光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權利要求1所述的光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法，其特征在于，s2包括以下步驟：

3.如權利要求2所述的光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法，其特征在于，所述第二切口的長度為0.3cm。

4.如權利要求1所述的光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法，其特征在于，步驟s3中所述光敏劑為孟加拉紅，劑量為50mg/kg。

5.如權利要求1所述的光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法，其特征在于，照射激光的波長為520nm，功率為40mw，照射時間為3分鐘。

6.如權利要求1所述的光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法，其特征在于，所述激光光斑直徑為0.7mm。

7.如權利要求1所述的光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法，其特征在于，激光聚焦過程中可采用10-20mw頻率的激光進行光斑大小及照射位置的調整。

技術總結
本發明屬于生物醫藥領域，提供了一種光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法，包括以下步驟：S1：誘導麻醉小鼠，并保障小鼠持續處于麻醉狀態；S2：小鼠側臥位，對一側面部脫毛、消毒，從小鼠面部切口，暴露小鼠大腦中動脈M3段近心端位置，或大腦中動脈分支血管反向延長線的交叉點；S3：給小鼠注射光敏劑，待光敏劑在小鼠體內循環均勻，激光聚焦后照射大腦中動脈M3段近心端或大腦中動脈分支血管反向延長線的交叉點；S4：激光照射結束后，縫合皮膚，停止麻醉，小鼠傷口涂布鎮痛藥。通過本發明提供的光化學誘導小鼠腦缺血模型的構建方法獲得的模型的梗死體積更大，梗死侵入皮層下腦區，因而缺血腦組織的病理特征更為明顯。

技術研發人員：馮梓瑩,馬寅仲,暢君雷,何岍妍,王悅慶
受保護的技術使用者：中國科學院深圳先進技術研究院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28