專(zhuān)利名稱(chēng)：受化學(xué)物質(zhì)烯丙異噻唑誘導(dǎo)的W－box元件及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種受化學(xué)物質(zhì)烯丙異噻唑或其活性代謝物誘導(dǎo)的順式元件及其應(yīng)用。該順式元件來(lái)源于大麥中抗病相關(guān)基因上游的啟動(dòng)子序列。將編碼所希望的目的產(chǎn)物基因的核苷酸序列和單元件或其順式串連重復(fù)后得到的啟動(dòng)子融合得到重組DNA，用這種重組DNA轉(zhuǎn)化植物，將得到新的轉(zhuǎn)基因植物。在新的植物中該重組DNA中的目的基因的表達(dá)受烯丙異噻唑probenazole(3-allyloxy-1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide，PBZ)或其活性代謝物1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide(BIT)的化學(xué)誘導(dǎo)物調(diào)控。
背景技術(shù)：
在過(guò)去十多年中，人們已經(jīng)獲得了上百個(gè)在作物遺傳改良中有重要應(yīng)用價(jià)值的功能基因。隨著功能基因組研究的進(jìn)展，人們還會(huì)批量地克隆出有廣泛應(yīng)用價(jià)值的功能基因。這些多樣性的基因資源將會(huì)被用來(lái)大規(guī)模地改良作物和其它重要植物，以便滿足人口增長(zhǎng)導(dǎo)致對(duì)糧食日益增長(zhǎng)的需求，緩解環(huán)境治理和保護(hù)的巨大壓力，以及為城鎮(zhèn)居民提供豐富的生活必需品和高質(zhì)量的生活環(huán)境。這些多樣性的功能基因資源需要在不同類(lèi)型啟動(dòng)子的調(diào)控下才能恰到好處地發(fā)揮作用。
一般來(lái)說(shuō)，啟動(dòng)子是位于基因編碼區(qū)上游的一段DNA，包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。啟動(dòng)子區(qū)域同時(shí)包含多種調(diào)控基因表達(dá)的元件，如大約位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游30bp(-30)位置的TATA box，以及位于上游75bp位置的CAAT box。植物啟動(dòng)子中還包含可以感應(yīng)其他外界因素的調(diào)控元件，諸如光、化學(xué)物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)條件、熱、缺氧、重金屬等環(huán)境因子，進(jìn)而對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。啟動(dòng)子內(nèi)的另外一些DNA序列與發(fā)育的時(shí)序或基因表達(dá)的組織特異性有關(guān)。真核體系中還存在增強(qiáng)子序列，可以大大提高附近基因的表達(dá)水平；這些增強(qiáng)效應(yīng)與其所處的位置和方向沒(méi)有多大關(guān)系。
近年來(lái)，植物基因工程技術(shù)在作物品種的遺傳改良方面，特別是在抗病蟲(chóng)特性和抗除草劑特性，以及谷物籽粒品質(zhì)改良上取得了令人矚目的成就和進(jìn)展，而且在許多其它方面也愈來(lái)愈顯示出了其巨大的應(yīng)用潛力，如植物生物反應(yīng)器的構(gòu)建等。然而，在取得這些突破性進(jìn)展的同時(shí)，關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物的生態(tài)安全和食品安全問(wèn)題也引起了公眾越來(lái)越多的關(guān)注、爭(zhēng)論甚至抗議。這中間除了非理性和非科學(xué)因素外，現(xiàn)行的選擇性基因和目標(biāo)功能基因的表達(dá)體系也的確存在其內(nèi)在的局限性。自然狀態(tài)下，生物體內(nèi)基因的表達(dá)都受到嚴(yán)格的調(diào)控。調(diào)控因子可能是發(fā)育進(jìn)程相關(guān)的，表現(xiàn)為基因的程序化表達(dá)，包括時(shí)空表達(dá)；也可能是環(huán)境因子誘導(dǎo)的，表現(xiàn)為基因的應(yīng)急式表達(dá)。然而，目前植物基因工程中所用的啟動(dòng)子多為組成型的，這些組成型的啟動(dòng)子驅(qū)使選擇性標(biāo)記基因和目標(biāo)功能基因持續(xù)高效表達(dá)，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)和轉(zhuǎn)基因植物的安全性問(wèn)題埋下了隱患。事實(shí)上，選擇性標(biāo)記基因只需要在篩選轉(zhuǎn)化體時(shí)表達(dá)；抗病蟲(chóng)、抗除草劑及生物反應(yīng)器中的目標(biāo)功能基因也只是在生長(zhǎng)發(fā)育特定的階段需要表達(dá)，許多時(shí)候甚至僅僅是短暫的表達(dá)。對(duì)植物而言，外源基因的無(wú)效持續(xù)表達(dá)不僅是物質(zhì)和能量不必要的消耗，而且還干擾植物細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，影響收獲器官的產(chǎn)量和品質(zhì)，甚至還會(huì)引起性狀喪失等后果。最近在Bt(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白轉(zhuǎn)基因棉花上已發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)毒性蛋白基因長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)，易導(dǎo)致棉鈴蟲(chóng)對(duì)毒性蛋白產(chǎn)生抗性(Mcaughey et al.，Nature biotechnol16144-146.1998)。以植物作為生物反應(yīng)器也存在類(lèi)似的問(wèn)題。對(duì)于生態(tài)環(huán)境而言，持續(xù)表達(dá)的外源基因可能會(huì)通過(guò)花粉或其它途徑在近緣物種間轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致有潛在危害的部分選擇性基因或功能基因及其控制的性狀逃逸，進(jìn)而對(duì)整個(gè)食物鏈和生物多樣性造成難以預(yù)料的后果。
為了克服組成型啟動(dòng)子在植物基因工程中的這些缺點(diǎn)，人們已經(jīng)考慮開(kāi)發(fā)利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，組織特異性/發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子應(yīng)用于植物基因工程有許多突出的優(yōu)勢(shì)，主要體現(xiàn)在1、目標(biāo)功能基因可以根據(jù)需要誘導(dǎo)表達(dá)；2、基因的表達(dá)水平可以通過(guò)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)劑/因子的強(qiáng)度而得到調(diào)節(jié)；3、通過(guò)使用不同的誘導(dǎo)劑/因子組合可以調(diào)節(jié)相關(guān)功能基因的協(xié)同表達(dá)。
在植物上，創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是較早被研究的、試圖用于抗病蟲(chóng)基因工程的一種誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)(Lorberth et al.，Plant J.2477-86.1992)。但是由于這類(lèi)啟動(dòng)子是借助于病蟲(chóng)侵害引起的創(chuàng)傷來(lái)誘導(dǎo)目標(biāo)功能基因表達(dá)，所誘導(dǎo)的抗病蟲(chóng)基因表達(dá)的速度和強(qiáng)度不足以產(chǎn)生及時(shí)有效的抗性，因而不能產(chǎn)生理想的抗性效果。此外，其它機(jī)械損傷，如暴風(fēng)雨等，也能引起抗病蟲(chóng)基因不必要的表達(dá)。
其次，缺氧誘導(dǎo)的玉米乙醇脫氫酶Adh I基因的啟動(dòng)子可能是研究得最為詳盡的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子之一。
通過(guò)電穿孔的方法，將缺氧誘導(dǎo)的玉米乙醇脫氫酶Adh I基因轉(zhuǎn)化源于懸浮培養(yǎng)的玉米原生質(zhì)體。轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體置于低氧含量處，并于20小時(shí)后分析Adh I的表達(dá)。為便于測(cè)量缺氧誘導(dǎo)的Adh I表達(dá)，將天然Adh I基因5’調(diào)控片段(1096 bp)與CAT相連。他們的結(jié)果顯示，在源于同源的培養(yǎng)細(xì)胞的原生質(zhì)體中，標(biāo)準(zhǔn)的缺氧條件可以調(diào)控單子葉植物玉米的Adh I啟動(dòng)子/CAT基因。同時(shí)，他們又發(fā)現(xiàn)，在玉米原生質(zhì)體中，Adh I的啟動(dòng)子片段本身就足以響應(yīng)缺氧條件的誘導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控外源基因的表達(dá)，無(wú)需編碼區(qū)和3’區(qū)的存在(Howard，et al.，Planta，170535-450.1987)。
其他研究者進(jìn)一步確定了玉米Adh I基因與缺氧誘導(dǎo)相關(guān)的DNA片段。這些研究者在玉米原生質(zhì)體中轉(zhuǎn)入包含CAT編碼序列和Adh I啟動(dòng)子的重組基因，24小時(shí)后檢測(cè)CAT活性。通過(guò)改變啟動(dòng)子片段的長(zhǎng)度，Lee等人確定從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游146 bp的啟動(dòng)子順序足以在缺氧狀態(tài)下啟動(dòng)CAT的表達(dá)。然而啟動(dòng)子序列向5’端繼續(xù)延伸到266或955 bp后，CAT表達(dá)量上升了5或8倍(Lee et al.，Plant Physiology 85327-330，1987)。
Walker等人繼續(xù)用瞬間表達(dá)方法研究玉米Adh I基因上游受缺氧誘導(dǎo)啟動(dòng)基因表達(dá)的序列。他們確定了啟動(dòng)子中與缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)相關(guān)的2段序列-133--124和-113--99(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游)。這2段序列對(duì)于誘導(dǎo)是必須的。在無(wú)親緣關(guān)系的病毒啟動(dòng)子前添加這段40bp的元件后可以獲得缺氧誘導(dǎo)性能(Walker et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 846624-6628，1987)。
另外有人發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草細(xì)胞內(nèi)，如果用玉米Adh I基因-1094-+106這一段調(diào)控CAT基因，在合適的缺氧條件下，有非常低的CAT基因表達(dá)。事實(shí)上，只檢測(cè)到CAT的mRNA。然而，將octopine合成酶基因或花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)的啟動(dòng)子元件接在Adh I啟動(dòng)子的5’端，可刺激CAT的表達(dá)，并在缺氧誘導(dǎo)后檢測(cè)到CAT。包含與Adh l基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5’相鄰序列247 bp的片段，足以將CAT基因的表達(dá)置于缺氧調(diào)控之下。因此，即使在有組成型的octopine合成酶或CaMV 35S啟動(dòng)子片段存在的條件下，這段247bp的順序的存在仍使基因的表達(dá)受缺氧調(diào)控(Eliset al.，EMBO Journal 611-16，1987)。Howard、Lee以及Walker等人通過(guò)瞬間表達(dá)分析獲得的受缺氧誘導(dǎo)調(diào)控的Adh I啟動(dòng)子區(qū)域與Ellis等人通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物所獲得的一致或類(lèi)似。
由于Adh I基因的啟動(dòng)子誘導(dǎo)響應(yīng)因子為缺氧狀態(tài)，因而在轉(zhuǎn)基因作物上的應(yīng)用沒(méi)有現(xiàn)實(shí)的可操作性。
在眾多誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中，化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在調(diào)控外源基因的表達(dá)上有許多突出的優(yōu)點(diǎn)，其中最主要的優(yōu)點(diǎn)是可控性強(qiáng)。高效、專(zhuān)一的化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子理論上可以用于各種類(lèi)型功能基因的安全表達(dá)，最理想的可能是用于抗病蟲(chóng)的植物基因工程和生物反應(yīng)器植物的構(gòu)建。
在細(xì)菌和動(dòng)物系統(tǒng)中已有不少能調(diào)控外源基因表達(dá)的誘導(dǎo)物/啟動(dòng)子組合。許多細(xì)菌內(nèi)的誘導(dǎo)體系是基于能夠響應(yīng)代謝物或其類(lèi)似物的啟動(dòng)子。用包含相關(guān)啟動(dòng)子的目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，在其培養(yǎng)基中加入合適的誘導(dǎo)物，便可以引起目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)。成熟的誘導(dǎo)物/啟動(dòng)子組合包括3-β-吲哚乙酸/色氨酸啟動(dòng)子，IPTG/lac啟動(dòng)子，磷酸鹽/磷酸鹽饑餓誘導(dǎo)啟動(dòng)子，以及L-阿拉伯糖/ara B啟動(dòng)子等。類(lèi)似地，重金屬/metallothionine啟動(dòng)子，熱/熱休克等啟動(dòng)子已應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中，調(diào)控外源基因的表達(dá)。
在植物上，除草劑安全劑誘導(dǎo)啟動(dòng)子是一類(lèi)研究得比較深入的實(shí)用型化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子，但由于其誘導(dǎo)特異性等方面尚存在一些問(wèn)題，目前尚未得到廣泛的應(yīng)用(Hershey et al.，Plant Mol Biol.17679-690，1991)。美國(guó)曾批準(zhǔn)一個(gè)除草劑安全劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的專(zhuān)利(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5364780)，研究者以第一個(gè)“適用于大田生產(chǎn)的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)而在轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子”得到了專(zhuān)利(1991年)。在進(jìn)一步的應(yīng)用中，他們將In2-2啟動(dòng)子與報(bào)告基因GUS相連，轉(zhuǎn)化擬南芥植物，通過(guò)組織化學(xué)的方法分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于不同類(lèi)型的除草劑安全劑，GUS分別表達(dá)于根、苗等不同組織中(De Veylder L et al.，Plant CellPhysiology，38(5)568-577，1997)。
其它報(bào)道的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有水楊酸、葡聚糖受體、Cu2+、醇類(lèi)、四環(huán)素、雌性激素、生長(zhǎng)素，細(xì)胞激動(dòng)素，赤霉酸，乙烯和脫落酸等誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Davies，P.(Ed.)PlantHormones and Their roles in Plant Growth and Development，Martinus Ni jhoff Publ.1987；Ebel et al.，1984)。這些啟動(dòng)子主要用于理論研究，不具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明所使用的化學(xué)誘導(dǎo)物質(zhì)--PBZ，是生產(chǎn)上使用多年的植物系統(tǒng)獲得性抗性的誘導(dǎo)劑，具有許多優(yōu)越性。首先，該藥劑對(duì)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯不利影響，對(duì)病原菌也沒(méi)有直接毒性，不易引起抗藥性，其誘導(dǎo)抗病機(jī)理主要是通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控體內(nèi)一系列相關(guān)基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的(Sakamoto et al.，Plant Mol Biol.40847-855，1999；Yoshioka et al.，Plant J.25(2)149-157，2001；丁德榮，復(fù)旦大學(xué)博士后出站報(bào)告，2001)。其次，它是一種防治稻瘟病的高效抗病性誘導(dǎo)劑，可以減輕由稻瘟病造成產(chǎn)量損失的80-90％，且效果穩(wěn)定，已經(jīng)成為東南亞稻區(qū)防治稻瘟病使用面積最大的抗病誘導(dǎo)劑(Zeigler，Leogler and Teng(Ed.)Strategies for the discovery of rice blast fungicides.inRice Blast Disease，CAB International Press.1994)。最后，烯丙異噻唑在植物體內(nèi)具有內(nèi)吸輸導(dǎo)性，克服了水楊酸等誘導(dǎo)劑在植物體內(nèi)不能輸導(dǎo)、易引起植物毒害的缺點(diǎn)(Kessmann，et al.，Annu Rev Phytopathol.32439-459，1994)。
綜上所述，烯丙異噻唑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用具有很大的可操作性，因而最有可能被應(yīng)用于調(diào)控大田轉(zhuǎn)基因植物中目的基因的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，烯丙異噻唑可以誘導(dǎo)水稻中一些抗病相關(guān)基因的增強(qiáng)表達(dá)，如RPR1基因。該基因的編碼產(chǎn)物含有亮氨酸富集重復(fù)區(qū)(LRR)和核甘酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)，這些是許多已知抗病基因所共有的特征。RPR1基因的表達(dá)還可以被常用的植物系統(tǒng)獲得性抗病性(SAR)誘導(dǎo)劑BTH和SA，以及病原菌的誘導(dǎo)(Sakamoto et al.，Plant Mol Biol.40847-855，1999)。在擬南芥上的研究發(fā)現(xiàn)，PBZ或其活性代謝產(chǎn)物BIT也能誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)。與常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑BTH和INA不同，PBZ是通過(guò)激活SA上游成分來(lái)激活SA/NPR1介導(dǎo)的防御信號(hào)途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)SAR，而前者似乎是作為SA的類(lèi)似物而發(fā)揮作用的(Yoshioka et al.，Plant J.25(2)149-157，2001)。
WRKY是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，因含有由WRKYGQK 7個(gè)氨基酸組成的保守序列而得名，在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中共發(fā)現(xiàn)了74個(gè)成員。WRKY蛋白能與TTGAC序列(又稱(chēng)W-box)專(zhuān)一結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)主要受病原菌、損傷和信號(hào)分子SA的誘導(dǎo)。除主要與植物的抗逆反應(yīng)和衰老有關(guān)外，WRKY也參與植物其他發(fā)育和代謝的調(diào)控。在植物的抗逆反應(yīng)過(guò)程中，WRKY的表達(dá)通常發(fā)生在誘導(dǎo)的早期，且不需要蛋白質(zhì)的重新合成。研究發(fā)現(xiàn)與WRKY專(zhuān)一結(jié)合的序列更多的存在于與抗病、損傷、衰老相關(guān)基因和水楊酸誘導(dǎo)基因的上游調(diào)控區(qū)域。此外，在果實(shí)成熟，種子表皮毛發(fā)育、蔗糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)了WRKY基因的表達(dá)。
本發(fā)明集中在來(lái)源于植物中受PBZ誘導(dǎo)的DNA啟動(dòng)子片段。這些啟動(dòng)子片段被用于建立一套PBZ/PBZ誘導(dǎo)基因的系統(tǒng)，并在轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控外源基因的表達(dá)。這一體系可用于在大田中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物中外源性調(diào)控目的基因的表達(dá)。它的優(yōu)勢(shì)包括這些啟動(dòng)子片段在用PBZ處理后表現(xiàn)出的高活性，在所有實(shí)驗(yàn)的植物組織中都有明顯的表達(dá)，以及沒(méi)有用化學(xué)物質(zhì)處理后產(chǎn)生的多效性等。
適用于大田生產(chǎn)的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)而在轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子，其表達(dá)的特異性必須便于對(duì)植物的外源性調(diào)節(jié)，所用的化學(xué)物質(zhì)應(yīng)當(dāng)能有多種使用的方法，且能誘導(dǎo)特異目的基因的表達(dá)。而PBZ在大田中的應(yīng)用已很普遍。有關(guān)PBZ誘導(dǎo)的啟動(dòng)子應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物方面的工作還未見(jiàn)報(bào)道。PBZ誘導(dǎo)啟動(dòng)子的應(yīng)用，將使人們能有效調(diào)控具有農(nóng)業(yè)價(jià)值的基因在轉(zhuǎn)基因植物中適時(shí)表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種受化學(xué)物質(zhì)烯丙異噻唑或其活性代謝物誘導(dǎo)的順式元件及其應(yīng)用，從而實(shí)現(xiàn)應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)控制轉(zhuǎn)基因植物或植物組織中基因的選擇性表達(dá)。
本發(fā)明提出的順式元件，是一個(gè)源于大麥且對(duì)PBZ的誘導(dǎo)作出應(yīng)答的一個(gè)順式作用元件，記為W-box，其核苷酸序列為SEQ.ID.NO.1。這一順式元件已構(gòu)建到含有非植物來(lái)源基因的重組載體中，轉(zhuǎn)化植物后發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平受化學(xué)物質(zhì)的調(diào)控。
特別地，本發(fā)明提出一核酸啟動(dòng)子，該核酸啟動(dòng)子片段受化合物烯丙異噻唑probenazole(3-allyloxy-1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide，PBZ)或其活性代謝物1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide(BIT)等誘導(dǎo)。因此在用化合物誘導(dǎo)后，帶有所述元件的轉(zhuǎn)基因植物會(huì)引起連接在所述啟動(dòng)子3’末端的一個(gè)編碼特定基因產(chǎn)物的DNA順序表達(dá)升高。
本發(fā)明的另一方面是提供一重組DNA載體。該載體含有上述順式元件W-box或其順式串連(即多個(gè)W-box順式串聯(lián))構(gòu)成的啟動(dòng)子。該載體轉(zhuǎn)化后的植物中，包含本發(fā)明中的上述啟動(dòng)子、與該啟動(dòng)子相連的編碼特定基因的DNA順序及合適的3’下游序列，使轉(zhuǎn)化該重組載體后的植物在化合物烯丙異噻唑(PBZ)或其活性代謝物BIT的作用下，特定基因產(chǎn)物水平上升。實(shí)施例中選擇的特定基因?yàn)榫幋aGUS的基因。
本發(fā)明還包括用本發(fā)明的重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物，這種轉(zhuǎn)基因植物用化合物烯丙異噻唑(PBZ)或其活性代謝物BIT處理引起編碼選擇的基因產(chǎn)物的DNA順序表達(dá)增高，該DNA順序經(jīng)操作連接在所述啟動(dòng)子片段的3’端。這樣的轉(zhuǎn)基因植物的種子同樣認(rèn)定為該發(fā)明的體現(xiàn)。
本發(fā)明最后還包括在植物中引起所選擇的基因產(chǎn)物表達(dá)增高的方法，它有幾個(gè)步驟組成a)用上述描述的重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物；b)用化合物PBZ處理轉(zhuǎn)基因植物；c)使轉(zhuǎn)基因植物在期望的時(shí)候增加所選擇的基因產(chǎn)物的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1W-box順式元件片段的獲得根據(jù)現(xiàn)有研究中對(duì)PBZ誘導(dǎo)基因的搜索、總結(jié)和生物信息學(xué)分析，PBZ誘導(dǎo)植物的SAR可能涉及到植物體內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中在植物抗逆抗病中均有重要作用的WRKY基因可能在PBZ誘導(dǎo)信號(hào)通路中具有重要作用；另外核苷酸序列分析也表明多個(gè)W-box(28bp，SEQ ID No.1)，存在于可受PBZ誘導(dǎo)的水稻抗病相關(guān)基因上游的啟動(dòng)子中。因此根據(jù)研究較多的大麥抗病相關(guān)基因5’上游啟動(dòng)子的序列(SEQ ID No.6)設(shè)計(jì)了人工合成核苷酸片斷5’CTAGACACACTTAATTTGACCGAGTAACATTCGCCACTAGTAAGCTTCTGCA3’(SEQ ID No.2)5’GAAGCTTACTAGTGGCGAATGTTACTCGGTCAAATTAAGTGTGT 3’(SEQID No.3)將人工合成的正義和反義核苷酸序列分別溶解，混勻后在PCR儀上退火，反應(yīng)條件為94℃變性5min，再按94℃60s，55℃30s，最后4℃保溫10min，形成雙鏈產(chǎn)物。電泳檢測(cè)并回收雙鏈產(chǎn)物。
將上述雙鏈產(chǎn)物作為插入片段與T-載體連接得到質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在涂有IPTG和X-gal的含有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，獲得含有W-box的重組子。以該質(zhì)粒為模板，以相應(yīng)的做PCR，驗(yàn)證是否有正確片段插入。將確實(shí)含有正確插入片段的克隆進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步確認(rèn)W-box序列的正確性。
實(shí)施例2帶啟動(dòng)子片段的植物轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的質(zhì)粒用XbaI和SpeI雙酶切，電泳，回收得到W-box順式元件序列。將該序列以1X、2X和4X的三種組合方式，克隆到pCAMBIA 1301雙元轉(zhuǎn)化載體上的基本啟動(dòng)子(mini promoter)的上游，驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)，相應(yīng)獲得三種載體pCW-box1、pCW-box2(SEQ ID No.4)、pCW-box3(SEQ ID No.5)。經(jīng)PCR驗(yàn)證后用電擊法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株LBA4404。在含利福平、鏈霉素和卡那三種抗生素的LB固體培養(yǎng)基上篩選，挑單菌落，小管搖菌。以菌液為模板，以各片段相應(yīng)的引物對(duì)為引物做菌落PCR，驗(yàn)證各質(zhì)粒是否已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，陰性對(duì)照各反應(yīng)不加模板。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因植物受PBZ誘導(dǎo)驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的研究將帶有pCW-box1、pCW-box2、pCW-box3的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥。28℃，120rpm培養(yǎng)農(nóng)桿菌菌株到OD600＝1.2；5000rpm(所用離心機(jī)為Hitachi CR22E，轉(zhuǎn)頭為R22A2，24號(hào))，4℃，10min離心，多次離心收集菌體；5％蔗糖溶液懸浮菌體至OD600＝0.8，菌體均勻懸浮成混濁液后加入Silwet L-77(0.03％)；將植株倒浸在菌液中3s；隱蔽保濕24小時(shí)，轉(zhuǎn)到正常條件下培養(yǎng)。
經(jīng)轉(zhuǎn)化的T0代擬南芥所結(jié)種子(T1代)在4℃冰箱黑暗條件下春化一個(gè)星期后，開(kāi)始篩選。種子分裝于1.5ml的Ep管，每管約100ul體積，加升汞(0.1％HgCl2)1ml滅菌6分鐘，用無(wú)菌水清洗5次，最后用無(wú)菌水重懸后，轉(zhuǎn)移到潮霉素30mg/L的MS培養(yǎng)基上，使種子在培養(yǎng)基上均勻分布，吸去多余水分，封口膜封口。在擬南芥培養(yǎng)室中，篩選7天。挑選明顯為深綠色、根系長(zhǎng)、植株高的擬南芥植株移栽到土中。移栽之前先澆水，移栽后保鮮膜覆蓋四天。植株生長(zhǎng)到一定時(shí)期，取葉片提取DNA。以之為模板，以轉(zhuǎn)化入片段的相應(yīng)引物對(duì)為引物做PCR，驗(yàn)證是否為轉(zhuǎn)基因植株。
T1代植株單株收種(T2代)，在4℃冰箱黑暗條件下春化一個(gè)星期后，開(kāi)始篩選。種子分裝于1.5ml的Ep管，每管約100ul體積，加升汞(0.1％HgCl2)1ml滅菌6分鐘，用無(wú)菌水清洗5次，最后用無(wú)菌水重懸后，轉(zhuǎn)移到潮霉素30mg/L的MS培養(yǎng)基上，使種子在培養(yǎng)基上均勻分布，吸去多余水分，封口膜封口。在擬南芥培養(yǎng)室中，篩選7天。挑選潮霉素抗性分離比為3∶1的株系，用Southern分子雜交挑選單拷貝插入的株系，將單拷貝插入株系的抗性植株移栽到土中。將收到的種子(T3代)通過(guò)潮霉素篩選來(lái)確定其是否是純合株系，將經(jīng)過(guò)鑒定為純合的株系的種子即T3代在土中播種。以其4-6周正常生長(zhǎng)植株為材料，檢測(cè)啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的情況。
作為擬南芥轉(zhuǎn)化和GUS表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照，以含35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的pCAMBIA1301載體轉(zhuǎn)化擬南芥，得到10株轉(zhuǎn)基因植株，其中四株用于T3代分析。這四株正常生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因材料在四周后將整株擬南芥從土中拔出，盡量不損壞根部。用水將植株清洗干凈并用濾紙吸去多余水分，然后將整株植物放于小培養(yǎng)皿中，以X-Gluc染液染色，檢測(cè)GUS表達(dá)。四個(gè)植株均檢測(cè)到GUS表達(dá)，且藍(lán)色出現(xiàn)在植株的各個(gè)部位，包括葉片、葉柄、葉原基、根等。
GUS染色的陰性對(duì)照一，即經(jīng)PBZ處理的處于相同生長(zhǎng)時(shí)期的野生型擬南芥四株，未檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)。
這些結(jié)果表明，我們擬南芥轉(zhuǎn)化以及GUS基因表達(dá)的檢測(cè)系統(tǒng)是可靠的。
pCW-box1、pCW-box2、pCW-box3轉(zhuǎn)化擬南芥分別得到9、7、11株轉(zhuǎn)基因植株，分別命名為pCW-box1(1)-pCW-box1(10)、pCW-box2(1)-pCW-box2(9)、pCW-box3(1)-pCW-box3(12)。
將pW-box1、pCW-box2、pCW-box3轉(zhuǎn)化得到的部分轉(zhuǎn)基因株系分別用水和PBZ處理3天后，將整株植物進(jìn)行GUS表達(dá)分析，檢測(cè)GUS基因的表達(dá)。pCW-box1轉(zhuǎn)化的四個(gè)植株中，有3株顯示GUS表達(dá)，表達(dá)只出現(xiàn)在整個(gè)葉片和部分根部。pCW-box2、pCW-box3轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出的組織定位類(lèi)似，但表達(dá)強(qiáng)度明顯不同。
將pCW-box1、pCW-box2、pCW-box3轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因株系分別用水和PBZ處理3天后，取充分展開(kāi)葉片進(jìn)行GUS酶活定量分析，結(jié)果顯示不同的串連元件重復(fù)表現(xiàn)出酶活的梯度，但酶活的大小與元件的多少并不呈現(xiàn)正線性相關(guān)，且其本底表達(dá)量隨元件串連的增加也同時(shí)表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，其中pCW-box2表現(xiàn)出最佳的PBZ誘導(dǎo)活性。
在陰性對(duì)照二中，即在轉(zhuǎn)含有基本啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的載體的植株中，能檢測(cè)到GUS基因的微量表達(dá)，主要集中于葉柄基部，且其表達(dá)不受PBZ處理的影響。
以上結(jié)果表明，人工合成的W-box序列在轉(zhuǎn)基因擬南芥中可響應(yīng)PBZ的誘導(dǎo)，具有可誘導(dǎo)的啟動(dòng)活性，并且其整體活性和誘導(dǎo)活性均可通過(guò)技術(shù)手段進(jìn)行調(diào)節(jié)，其中W-box的2X順式串連后表現(xiàn)出較強(qiáng)的整體活性和較低的本底表達(dá)，具有最佳的PBZ誘導(dǎo)活性。本發(fā)明涉及的序列SEQ ID No1的信息長(zhǎng)度28堿基類(lèi)型核酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型寡核苷酸序列描述SEQ ID No1CACTTAATTTGACCGAGTAACATTCGCCSEQ ID No2的信息長(zhǎng)度47堿基類(lèi)型核酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型寡核苷酸序列描述SEQ ID No2CTAGACACACTTAATTTGACCGAGTAACATTCGCCACTAGTAAGCTTCTGCASEQ ID No3的信息長(zhǎng)度39堿基類(lèi)型核酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型寡核苷酸序列描述SEQ ID No3GAAGCTTACTAGTGGCGAATGTTACTCGGTCAAATTAAGTGTGTSEQ ID No4的信息長(zhǎng)度71堿基類(lèi)型核酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型寡核苷酸序列描述SEQ ID No4CTCTAGACACATTTAATTTGAAGTAACATTCCCCACTAGACACACTTAATTTGAAGTAACATTCCCCACTASEQ ID No5的信息長(zhǎng)度132堿基類(lèi)型核酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型基因組DNA序列描述SEQ ID No5CTCTAGACACATTTAATTTGAAGTAACATTCCCCACTAGACACACTTAATTTGAAGTAACATTCCCCACTAGACACACTTAATTTGAAGTAACATTCCCCACTAGACACACTTAATTTGAAGTAACATTCGCCACTAGTASEQ ID No6的信息長(zhǎng)度1520堿基類(lèi)型核酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類(lèi)型基因組DNA序列描述SEQ ID No61 CGTATTCGAA TTCGAATACG GATAATATCC GTTTTTTTCC GGATACGAAT GCAGATATTT61 CAGACGGATT TTGGATTTTT TGATGATCCT GTCATATTAT TGATGATTTC AGAACAATTT121 TTTACCGTTA AACTCAAATA ATATTTTACT ATATGTATAA AATATTTGTA CAATTATATA
181 AAATTTGTAT AAATGTATTA TTTAATGTAT ATACACATAT TATAAAATAA TTGAATAAAT241 TTAAATTATT TAATATTTAT ATATATTCGG ATTCGAATAT CCCGGATTCG GATACGGATA301 ATATCCACTT TTTTTCGGAT ACGGATAATA TCCGCTTTTT CCTGGATACG AATACGGATT361 TTTCGGACGG ATATCGGATT TTTCGAATTT TTTTTACAGC CTAAATGTTA CAATATATAT421 GTCACATGCA GCTACGCCTG CGCCTTATGC ATAAGATGTG TAGAAGTCAT ATTGCACATA481 CTTGTCAACT ATCCTGATTA TGTTATATAA ACAAATATCA TCGGGTAGGG ATTACTGACC541 TTGTGATTAC TCTGATCATG TTTAACAATT AAGAGCAGTA GTTATCATTA ATTCCTTTTA601 CAATCAATTT TGTTCTAATT CTAAACTTTA TTATAAATCC ATGTCTATTG ATCTCTAAGT661 ACACAAACCC GTTTATTTAT TATGACTAAA TAGTCAGAAT TTCCAACATT TGAAAGTTGA721 TTAAAAATTT ATTCAAACTT ACAGGAGTAA GAAATGAATT AGTTGAAGAA CTTGCAATAA781 ATATGAAGTG GACAATACAA AAAATTTGCT TATTACACAC TTAATTTGAC CGAGTAACAT841 TCACCTGTAT ATTGCCTATC AGTCGAGTCA TAGATTATTG TCTTCGTGGA AAATTGGTTA901 TGTAATGCCA ATCACTAGTC ACTATTAATA TTACCTGGTC AGCTTTCATA ACTGTTTTAT961 TAAATATACA AATAAATAAT GAAAATGAGA AGATCATGCT ATCAAATAAT TCATGTAGAC1021 AAGTTGAGAT CCAGATTGAG ATCCAGATTG AACACTATAA ATAGCAGCTC AAACTACTCT1081 TATTTACTCG TACCAATCTC AAAACACATA CATTCAAACC TGATTTTCTT CCTCTCTTCT1141 TATTTTCTCT CGTCAGTTTA TATTAACATA TAATGGGTGT TCAAAAGAGT GAAGTCGAAA1201 CTACTTCTTC CGTCTCAGCA GAGAAATTGT TCAAGGGTTT ATGCCTCGAC ATCGATACCC1261 TTCTTCCTCA GGTTCTCCCT GGTGCTATCA AGAGTTCTGA AACCCTTGAG GG
權(quán)利要求
1.一種受化學(xué)物質(zhì)烯丙異噻唑誘導(dǎo)的順式元件，其特征在于是一個(gè)源于大麥且對(duì)PBZ的誘導(dǎo)作出應(yīng)答的一個(gè)順式作用元件，其核苷酸序列為SEQ.ID.NO.1，記為W-box。
2.一重組載體，其特征在于該載體含有權(quán)利要求1所述的順式元件w-box或其順式串連構(gòu)成的啟動(dòng)子；該載體轉(zhuǎn)化后的植物中，包含所述核酸啟動(dòng)子片段、與該啟動(dòng)子相連的編碼特定基因的DNA順序及合適的3’下游序列，使轉(zhuǎn)化該重組載體后的植物在有化合物烯丙異噻唑或其活性代謝物的作用下，特定基因產(chǎn)物水平上升；其中的選擇的基因?yàn)榫幋aGUS的基因。
3.一種用權(quán)利要求2所述的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的植物，這種轉(zhuǎn)基因植物用化合物烯丙異噻唑或其活性代謝物處理引起編碼選擇的基因產(chǎn)物的DNA順序表達(dá)增高，該DNA順序經(jīng)操作連接在所述啟動(dòng)子片段的3’端。
4.一種由權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物的種子。
5.一種在植物中引起所選擇的基因產(chǎn)物表達(dá)增高的方法，其特征在于具體如步驟如下a)用上述描述的重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物；b)用化合物烯丙異噻唑或其活性代謝物處理轉(zhuǎn)基因植物；c)使轉(zhuǎn)基因植物在期望的時(shí)候增加所選擇的基因產(chǎn)物的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離和利用核酸的順式元件，該元件來(lái)源于大麥中抗病相關(guān)基因上游的啟動(dòng)子序列。將編碼所希望的目的產(chǎn)物基因的核苷酸序列和單元件或其順式串連重復(fù)后得到的啟動(dòng)子融合得到重組DNA，用這種重組DNA轉(zhuǎn)化植物，將得到新的轉(zhuǎn)基因植物。在新的植物中該重組DNA中的目的基因的表達(dá)受烯丙異噻唑probenazole(3－allyloxy－1，2－benzisothiazole－1，1－dioxide，PBZ)或其活性代謝物1，2－benzisothiazole－1，1－dioxide(BIT)的化學(xué)誘導(dǎo)物調(diào)控。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1986796SQ20061014725
公開(kāi)日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日
發(fā)明者蒯本科, 楊進(jìn)孝, 高炯, 周茜, 余進(jìn) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)