專利名稱：一種受化學物質烯丙異噻唑誘導的順式元件及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬基因工程技術領域，具體涉及一種受化學物質烯丙異噻唑或其活性代謝物誘導的順式元件，該順式元件來源于馬鈴薯中具抗病抗逆作用的基因上游的啟動子序列。將編碼所希望的目的產物基因的核酸序列和單元件或其順式串連重復后融合得到重組DNA，用這種重組DNA轉化植物，將得到新的轉基因植物。在這種轉基因植物中，該重組DNA中的目的基因的表達受烯丙異噻唑probenazole(3-allyloxy-1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide，PBZ)或其活性代謝物1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide(BIT)的化學誘導物調控。
背景技術：
在植物領域，轉基因技術已成為解決多細胞有機體生物所遇問題的強有力的工具，這包括將內源或外源基因引進植物以修飾某種功能或改變基因的表達模式。轉基因技術的成功往往依賴于有效的啟動子來控制轉入基因的表達，而隨著人們研究的積累，反向遺傳生物學的研究也成為可能。
基因表達是基因經過轉錄、翻譯、產生有活性的蛋白質的過程，轉錄是基因表達調控的重要環節。在真核體系中，基因的表達是受一段稱為啟動子的DNA調控的。真核生物的順式作用元件是基因周圍能與特異轉錄因子結合而影響轉錄的DNA序列。其中主要是起正調控作用的順式元件，包括啟動子和增強子。啟動子是RNA聚合酶結合并啟動轉錄的DNA序列，決定了基因轉錄的時間、空間和轉錄水平。啟動子中的元件又可分為核心啟動子元件和上游啟動子元件。核心啟動子元件指RNA聚合酶啟動轉錄所必需的最小的DNA序列，包括轉錄起始位點及其上游-25/-30bp處的TATA盒。上游啟動子元件包括通常位于-70bp附近的CAAT盒、GC盒以及距轉錄起始位點更遠的上游元件。啟動子中包含的其他調控元件可以感應諸如光、營養條件、熱、缺氧、重金屬等環境因素而對基因表達進行調控。啟動子內的其他DNA順序也許與發育的時序或基因表達的組織特異性有關。而且，真核體系中類似于增強子的順序可以大大提高附近基因的表達水平，且與其所處的位置和方向沒有多大關系。植物中也存在類似于增強子的序列。基本上，啟動子可分為組成型表達和誘導型表達兩種類型。對啟動子結構和順式作用元件的分析是啟動子研究的主要內容。克隆、分析和應用各種類型的啟動子，例如可誘導表達、組織特異性表達和發育階段特異性表達的啟動子，有利于分析基因功能和改良植物性狀。真核生物啟動子功能上的多樣性為分離受嚴謹調控的啟動子用于在轉基因植物中適時調控基因的表達提供了條件。
利用合適的外源性化學物質調控大田生長作物中某些基因的表達，對于農業生產和糧食生產相當關鍵，尤其是對于以下幾類在轉基因植物中有較高應用價值的基因(1)延長目的營養物質在種子、根、莖中的積累；(2)在植物生長發育周期內某一時段產生某產物并集聚于某一植物組織內以便于收集或/和分離；(3)在病原攻擊的位置啟動對于某一蟲害有特異毒性的毒素的表達。第二點可使生物反應器具有更高的效率，而最后一點也許能提供一種避免有毒物質對食品的污染以及通過對毒素的選擇性或組織特異表達而非組成型表達來降低蟲害對毒素產生抗性的幾率。由于至今沒有較成熟的在大田中可操作的外源控制植物基因表達的手段，以上及其他優點至今尚未很好地體現。
現今已有多種目的基因的利用途徑。這些基因或是在植物的生命周期內持續表達(受控于組成型啟動子)，或是受控于器官、組織、細胞固有的發育程序(時序或組織特異的啟動子)而使目的基因得到表達。持續表達無法控制基因在特定的生長階段、在特定的組織或是感應環境變化后表達。再者，如此組成型的表達會對產量產生不利的影響，因為這樣長期高表達單個基因的產物會大大增加對能量的消耗。組織特異性或時序特異性的表達雖然有利于在特定的時間和空間積累特定的產物，但它亦受到不同植物各自內在的發育和時空調控程序的影響。因此，若要應用于實際生產，需要分離到各種在不同植物的不同組織或不同生長階段特異發揮作用的啟動子，尤其是我們感興趣的農作物品種。
理想的條件下，人們希望通過可誘導信號來刺激目的基因在植物生命周期中的任意時刻及任何組織內的表達，以獲得對轉基因植物中目的基因表達的外源性調控。這一調控作用可以通過對誘導信號感應靈敏的啟動子控制結構基因表達的方式實現。理想的誘導物和啟動子的組合可適用于廣泛的植物種類，并且誘導物對植物正常的生長、發育和形態沒有太大的影響。符合以上要求的化學物質可在已有條件下方便地應用于大田農業生產。例如，化學誘導物可以由在種植者中廣泛應用的設備噴灑。理想的誘導物/啟動子組合可適用于轉基因植物的任何生長階段或任何組織，以調控各種目的基因的表達。
在細菌和動物系統中已有不少能調控外源基因表達的誘導物/啟動子組合。許多細菌內的誘導體系是基于能夠響應代謝物或其類似物的啟動子的。用包含相關啟動子的目的基因轉化細菌后，在其培養基中加入合適的誘導物，便可以引起目的產物的表達。這些誘導物/啟動子組合的例子有3-β-吲哚乙酸/色氨酸啟動子，IPTG/lac啟動子，磷酸鹽/磷酸鹽饑餓誘導的啟動子，以及L-阿拉伯糖/ara B啟動子等。類似的，重金屬/metallothionine啟動子，熱/熱休克等啟動子已應用于動物細胞的培養系統中，調控外源基因的表達。
現在已知有不少源于植物的誘導物/啟動子組合。這些啟動子的活化大多通過環境因子，比如光、熱擊和缺氧等。這些可誘導基因的啟動子被深入地研究過。然而，利用受環境因素調控的啟動子調控外源基因難以實際應用，因為這些誘導信號在農業生產的條件下難以控制。其他有一些植物基因據報道可以為病原侵染和/或傷害時所產生的寡糖所誘導。例如，在大豆中由葡聚糖受體誘導產生的苯丙氨酸脫氨酶和查爾酮合成酶(Ebel，J.，etal.，Arch.Biochem.Biophys.232，240-248，1984)，以及在土豆中受傷害誘導的抑制劑基因(Cleveland，T.E.et al.，Plant Mol.Biol.8，199-2081987)等。只是這些啟動子在轉化的植物中對調控外源基因的表達沒有多大作用，原因或是因為缺乏可操作的誘導方法(傷害)，或是因為在植物生長過程中需要分散能量來合成大量對抗病原侵染所造成不利影響的物質(寡糖誘導物)。
有許多化合物，包括天然化合物與合成化合物，都具有調控植物基因表達的潛力。然而，任何能夠作為誘導物用于大田的化合物必須對環境無害，對植物的生長發育及形態沒有很大影響，并便于以現有的手段用于農業生產。
有一些天然產物已知可以影響基因的表達。這些化合物大多是植物生長調節因子，比如生長素，細胞激動素，赤霉酸，乙烯和脫落酸等(c.f.，Davies，P.(Ed.)Plant Hormonesand Their roles in Plant Growth and Development，Martinus Nijhoff Publ.1987)，其他如水楊酸等的化合物也有很強的作用(Hooft Vanhuijsduijnen et al.，J.Gen.Virol.，67235-2143，1986)。當上述這些生長調節因子用于不同植物的細胞、組織或器官后，可以觀察到代謝狀態的變化，這至少在一定程度上與新的基因表達有關。一些基因產物以及基因本身已經得到分離和鑒定。然而，鑒于這些化合物誘導的基因通常是與調節植物生長和發育相關的，它們難以用作為轉基因植物中化學可誘導基因的誘導劑。其直接原因是這一類物質會同時激活不必需的植物內源性對激素敏感的發育程序，從而造成不必要的多效性。例如，對在發育過程中的植物用脫落酸激活外源基因的表達會同時激活不必需的激素效應，影響植物的代謝(Milborrow，B.V.An.Rev.Plant Physiol.25，259-2071974)，造成生長大大遲緩以及在成熟前嫩葉和果實的脫落。其他植物激素也有類似的對植物生長發育不利的影響，因此也無法應用于調控轉基因植物中外源基因的表達。更綜合的有關諸如脫落酸、乙烯、細胞激動素和生長素之類的植物激素對食用植物影響的綜述可見Phytohormones and Related compoundsA Comprehensive Treatise Vols I & II(Letham，D.S.，Goodwin，P.S.，and Higgis，T.G.V.eds.Elsevier/North Holland，1978)。
烯丙異噻唑probenazole(3-allyloxy-1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide，PBZ)，是防治稻瘟病的優良藥劑，是目前日本殺菌劑中產量最大的品種之一。PBZ本身或其代謝物不影響稻瘟病菌的生長和對植物的侵染能力，它可能是通過激活植物自身的抗病機制而使植物產生抗病性(Michiaki lwata，The Royal Society of Chemistry Pesticide Outlook，28-31，2001)。PBZ可誘導擬南芥和煙草等雙子葉植物產生系統獲得抗性，在水稻等單子葉植物中可通過類似系統獲得抗性的途徑誘導植物產生抗病性。
在二十世紀八十年代，隨著玉米中解除除草劑毒性谷胱甘肽-S-轉移酶(Glutathione S-Transferase，GST，EC 2.5.1.18)基因的克隆，發現GST基因普遍存在于動植物中，其序列于動植物中存在明顯差異，到目前為止，擬南芥中已發現48個GST基因。谷胱甘肽-S-轉移酶，是由GST基因家族編碼的一類變異范圍廣，具有多功能的酶。植物GST酶可分為Phi、Tau、Therta、和Zeta、四類；其中Theta和Zeta是植物和動物中共有，Phi和Tau為植物所特有。GST酶的功能主要表現在以下幾個方面(a)解除外界毒素以及內源有毒代謝物的侵害；(b)具有過氧化物酶活性，能解除羥基過氧化物的毒性；(c)抑制細胞程序化死亡功能；(d)在激素的穩定和液胞花色素苷的匯集中以非催化載體起作用；(e)在Tyr代謝中催化異構化作用；(f)脅迫信號蛋白的角色。在植物組織中有GST的表達，但不同物種、不同組織和不同細胞中所含的GST同工酶種類各異，各種同工酶的表達水平不同，即GST基因的表達具有組織特異性，在植物中，除草劑、病原微生物、重金屬離子、鹽脅迫、高溫、冷害、機械損傷等都會誘導一些GST基因的表達，表明其啟動子上元件誘導活性的多樣性，但其與PBZ的關系尚無任何報道。
本發明集中在來源于植物中受PBZ誘導的DNA啟動子片段。這些啟動子片段被用于建立一套PBZ/PBZ誘導基因的系統，并在轉基因植物中調控外源基因的表達。這一體系可用于在大田中生長的轉基因植物中外源性調控目的基因的表達。它的優勢包括這些啟動子片段在用PBZ處理后表現出的高活性，在所有實驗的植物組織中都有明顯的表達，以及沒有用化學物質處理后產生的多效性等。
化學誘導啟動子在轉基因植物系統中應用的可行性方面，許多工作從不同角度進行了研究。
Ebert等人開始了對包含nopaline合成酶啟動子的DNA片段的研究(Ebert et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 845745-5749，1987)。該啟動子源于細菌，為組成型而非誘導型，且廣泛地用于植物組織中。構建載體，使該啟動子調控下游報告基因CAT。作者發現一段33bp的DNA片段(-97--130)對CAT的表達是必需的。同時他們發現2個該片段可以使CAT表達水平上升3倍。這一在煙草組織中穩定轉化的結果在煙草原生質體中的瞬間表達分析得到了重復。比較穩定轉化和瞬間表達的CAT在煙草組織和原生質體中受該33bp片段調控的表達水平情況，兩者表現相同。作者無疑是想表明瞬間表達分析對于研究啟動子在穩定轉化體系的表現是很有幫助的。
已有對缺氧誘導的玉米乙醇脫氫酶Adh I基因的研究，通過電穿孔的方法將Adh I基因片段轉化源于懸浮培養的玉米原生質體(Howard，et al.，Planta，170535-450 1987)。轉化后的原生質體置于低氧含量處，并于20小時后分析Adh I的表達。為便于測量缺氧誘導的Adh I表達，將天然Adh I基因5’調控片段(1096bp)與CAT相連。他們的結果顯示，在源于同源的培養細胞的原生質體中，標準的缺氧條件可以調控單子葉植物玉米的Adh I啟動子/CAT基因。同時，他們又發現，在玉米原生質體中，單單Adh I的啟動子片段足以受缺氧條件誘導而調控外源基因表達，而無需編碼區和3’區的存在。
其他一些研究者(Lee et al.，Plant Physiology 85327-330 1987)進一步確定了玉米Adh I基因與缺氧誘導相關的DNA片段。這些研究者在玉米原生質體中轉入包含CAT編碼順序和Adh I啟動子的重組基因，并于24小時后檢測CAT活性。通過改變啟動子片段的長度，Lee等人確定從轉錄起始位點上游146bp的啟動子順序足以在缺氧狀態下啟動CAT的表達。然而啟動子順序向5’端繼續延伸到266或955bp后，CAT表達量上升了5或8倍。
Walker等人繼續用瞬間表達方法研究玉米Adh I基因上游受缺氧誘導啟動基因表達的順序(Walker et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 846624-66281987)。他們確定了啟動子中與缺氧誘導的基因表達相關的2段順序-133--124和-113--99(轉錄起始位點上游)。這2段順序對于誘導是必須的。在一無關聯的病毒啟動子前添加這段40bp的元件后可以受缺氧誘導。
另外有人發現在穩定轉化的煙草細胞內，如果用玉米Adh I基因-1094-+106這一段調控CAT基因，在合適的缺氧條件下，有非常低的CAT基因表達(Ellis et al.，EMBOJournal 611-161987)。事實上，只檢測到CAT的mRNA。然而，將octopine合成酶基因或花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)的啟動子元件接在Adh I啟動子的5’端，可刺激CAT的表達，并在缺氧誘導后檢測到CAT。包含與Adh I基因轉錄起始位點5’相鄰順序247bp的片段，足以將CAT基因的表達置于缺氧調控之下。因此，即使在有組成型的octopine合成酶或CaMV 35S啟動子片段存在的條件下，這段247bp的順序的存在仍使基因的表達受缺氧調控。Howard、Lee以及Walker等人通過瞬間表達分析獲得的受缺氧誘導調控的Adh I啟動子區域與Ellis等人通過穩定轉化植物所獲得的一致或類似。
已有在動物和微生物體系中化學誘導目的基因表達的專利獲得批準。美國專利號為4579821的專利授予Palmiter和Brinster，他們分離了小鼠金屬硫因-1(metallothionein-1)基因的調控序列并將其與特定的DNA序列連接，在有重金屬或膽固醇的條件下控制基因表達。在分化后的成年鼠細胞用鈣離子或地塞米松處理后，受金屬硫因-1啟動子調控的胸苷激酶表達。美國專利號4703005的專利授予Nakata和Shinagawa，他們分離了一個磷酸鹽結合蛋白的基因phoS，在其3’端連上一個外源基因。在培養基上，該外源基因可由磷酸鹽調控。以上這些發明都難以應用于大田作物。可激活金屬硫因啟動子的重金屬離子不僅對植物有毒，而且會對土地造成巨大的污染。類似的，受如磷酸鹽等營養物調控的啟動子也無法用于大田，因為大田中難以維持營養物水平的穩定。
有些報道試圖在轉基因植物中調控基因的表達。歐洲專利申請號85302593.0的專利從大豆中分離到4個熱休克基因的啟動子并聲稱它們可以促使轉基因植物中外源基因的表達。在申請書中，作者聲稱使用這些啟動子可以暫時活化外源基因的表達，比如Basillusthuringenesis的crystalline毒素蛋白的結構基因，或是在體內對熱擊響應而表達的抗除草劑基因。然而，如此將基因表達與熱休克啟動子相聯系的辦法難以適用于大田中每天溫度的變化。
Marcotte和Quatrano(J.Cellular Biochem.Supplement 12C，1988；Marcotte，W.R.，Bayley，C.C.，and Quatrano，R.S.，Nature 335，454-457 1988)報道了對一融合基因的可誘導性研究的最初數據。該融合基因的轉錄受來源于2個小麥中ABA誘導的基因Em和7S球蛋白的基因啟動子調控。在用ABA誘導后，整個植株都有該基因的表達。看來誘導性至少是部分地發生在轉錄水平上。將包含不同長度的Em基因的5’區域的啟動子片段和GUS基因編碼區以及CaMV 35S轉錄子的poly A信號相連，通過在單子葉植物(水稻)和雙子葉植物(煙草)原生質體內的瞬間表達檢測ABA誘導的GUS活性。他們發現Em編碼區上游的一段區域(650bp)和7S球蛋白編碼區上游的區域(1800bp)足以在水稻原生質體中受ABA誘導后控制GUS的表達。Em啟動子在雙子葉植物的瞬間表達體系中對ABA沒有任何響應，暗示這一啟動子在雙子葉植物中沒有功能。然而，我們前面已經詳細討論過包括ABA在內的植物激素的誘導作用具有多效性，這樣就排除了利用其在大田生長的轉基因植物中調控基因表達的可能性。
歐洲對De Danske Sukkerfab A/B批準的專利(CC87-106623)宣稱找到一種用根/節特異性基因啟動子調控目的基因表達，以在豆科植物中改進固氮系統。發明者特別指出氯霉素乙酰轉移酶基因(CAT)受源于大豆豆血紅蛋白基因的啟動子調控，在轉基因植物的根中表達的誘導性與其它根特異基因表達類似，都受生節作用(nodulation)的影響。這個方法的局限性是明顯的，基因的表達只能通過生節作用誘導，而且誘導是根特異性的。它無法在任何時候或任何組織中通過外源調節的方法對大田生長的轉基因植物的基因表達進行調控。
美國曾批準一個除草劑安全劑誘導的啟動子的專利(美國專利號5364780)，研究者以第一個“適用于大田生產的化學物質誘導而在轉基因植物中調控目的基因表達的啟動子”得到了專利(1991年)。在進一步的應用中，他們將In2-2啟動子與報告基因GUS相連，轉化擬南芥植物，通過組織化學的方法分析發現對于不同類型的除草劑安全劑，GUS分別表達于根、苗等不同組織(De Veylder L etc.，Plant Cell Physiology，1997，Vol38，No.5568-577)。但磺酰脲類除草劑誘導系統的研究方面未見有專利申請。
適用于大田生產的化學物質誘導而在轉基因植物中調控目的基因表達的啟動子，其表達的特異性必須便于對植物的外源性調節，所用的化學物質應當能有多種使用的方法，且能誘導特異目的基因的表達。而PBZ在大田中的應用已很普遍。有關PBZ誘導的啟動子應用于轉基因植物方面的工作還未見報道。PBZ誘導啟動子的應用，將使人們能有效調控具有農業價值的基因在轉基因植物中適時表達。

發明內容
本發明的目的在于提供一種受化學物質烯丙異噻唑誘導的順式元件及其應用。從而實現應用化學物質控制轉基因植物或植物組織中基因的選擇性表達。
本發明提出的順式元件，是一個源于馬鈴薯、且對PBZ的誘導作出應答的一個順式作用元件，記為Gst1-box，其核苷酸序列為SEQ ID No.1。這一順式元件已構建到含有非植物來源基因的重組載體中，轉化植物后發現結構基因的表達水平受化學物質的調控。
特別地，本發明提供一核酸啟動子。該核酸啟動子片段受化合物烯丙異噻唑probenazole(3-allyloxy-1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide，PBZ)或其活性代謝物1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide(BIT)等誘導。因此在用化合物誘導后，帶有所述元件的轉基因植物會引起連接在所述啟動子3’末端的一個編碼特定基因產物的DNA順序表達升高。
本發明的另一方面提供一重組DNA載體。該載體含有上述順式元件(Gst1-box)或其順式串連構成(即多個Gst1-box順序串連)的啟動子。該載體轉化后的植物中，包含所述核酸啟動子片段、與該啟動子相連的編碼特定基因的DNA順序及合適的3’下游序列，使轉化該重組載體后的植物在化合物烯丙異噻唑(PBZ)或其活性代謝物BIT的作用下，特定基因產物水平上升。實施例中選擇的特定基因為編碼GUS的基因。
本發明還包括用本發明的重組DNA結構轉化植物，這種轉基因植物用化合物烯丙異噻唑(PBZ)或其活性代謝物BIT處理引起編碼選擇的基因產物的DNA順序表達增高，該DNA序列經操作連接在所述啟動子片段的3’端。這樣的轉基因植物的種子同樣認定為該發明的體現。
本發明最后還包括在植物中引起所選擇的基因產物表達增高的方法，它有幾個步驟組成a)用上述描述的重組DNA結構轉化植物；b)用化合物PBZ處理轉基因植物；c)使轉基因植物在期望的時候增加所選擇的基因產物的表達。
具體實施例方式
實施例1GST1順式元件片段的獲得根據現有研究中對PBZ誘導基因的搜索、總結和生物信息學分析，PBZ誘導植物的SAR可能涉及到植物體內多種信號轉導途徑，其中在植物抗逆抗病中均有重要作用的GST基因可能在PBZ誘導信號通路中具有重要作用；另外核苷酸序列分析也表明馬鈴薯GST1基因上游的啟動子中包含有可能的PBZ誘導元件(Gst1-box，SEQ ID No.1)。因此根據馬鈴薯GST1基因上游啟動子的序列(SEQ ID No.6)設計了人工合成核苷酸片斷5’CTAGATTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACACTAGTAAGCTTCTGCA 3’(SEQID No.2)5’GAAGCTTACTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAAT 3’(SEQ ID No.3)將人工合成的正義和反義核苷酸序列分別溶解，混勻后在PGR儀上退火，反應條件為94℃變性5min，再按94℃60s，55℃ 30s，最后4℃保溫10min，形成雙鏈產物。電泳檢測并回收雙鏈產物。
將上述雙鏈產物作為插入片段與T-載體連接得到質粒，并轉化大腸桿菌DH5α，在涂有IPTG和X-gal的含有氨芐抗生素的LB固體培養基上進行藍白斑篩選，獲得含有Gst1-box的重組子。以該質粒為模板，以相應的引物對做PCR，驗證是否有正確片段插入。將確實含有正確插入片段的克隆進行測序，進一步確認Gst1-box的正確性。
實施例2帶啟動子片段的植物轉基因載體的構建將經測序驗證的質粒用XbaI和SpeI雙酶切，電泳，回收得到GST1-box順式元件序列。將該序列以1X、2X和4X的三種組合方式，克隆到pCAMBIA 1301雙元轉化載體上的基本啟動子(mini promoter)的上游，驅動GUS基因的表達，相應獲得三種載體pCGST1、pCGST2(SEQ ID No.4)、pCGST3(SEQ ID No.5)，經PCR驗證后用電擊法分別轉化農桿菌菌株LBA4404。在含利福平、鏈霉素和卡那三種抗生素的LB固體培養基上篩選，挑單菌落，小管搖菌。以菌液為模板，以各片段相應的引物對為引物做菌落PCR，驗證各質粒是否已轉入農桿菌，陰性對照各反應不加模板。
實施例3轉基因植物受PBZ誘導驅動報告基因表達的研究將帶有pCGST1、pCGST2、pCGST3的農桿菌轉化擬南芥。28℃、120rpm轉速下培養農桿菌菌株，濃度至OD600＝1.2；5000rpm(所用離心機為Hitachi CR22E，轉頭為R22A2，24號)、4℃下離心10min，多次離心收集菌體。5％蔗糖溶液懸浮菌體至OD600＝0.8，菌體均勻懸浮成混濁液；加入Silwet L-77(0.03％)。將植株倒浸在菌液中3s；隱蔽保濕24小時，轉到正常條件下培養。
經轉化的T0代擬南芥所結種子(T1代)在4℃冰箱黑暗條件下春化一個星期后，開始篩選。種子分裝于1.5ml的Ep管，每管約100ul體積，加升汞(0.1％ HgCl2)1ml滅菌6分鐘，用無菌水清洗5次，最后用無菌水重懸后，轉移到潮霉素30mg/L的MS培養基上，使種子在培養基上均勻分布，吸去多余水分，封口膜封口。在擬南芥培養室中，篩選7天。挑選明顯為深綠色、根系長、植株高的擬南芥植株移栽到土中。移栽之前先澆水，移栽后保鮮膜覆蓋四天。植株生長到一定時期，取葉片提取DNA，以之為模板，以轉化入片段的相應引物對為引物做PCR，驗證是否為轉基因植株。
T1代植株單株收種(T2代)，在4℃冰箱黑暗條件下春化一個星期后，開始篩選。種子分裝于1.5ml的Ep管，每管約100ul體積，加升汞(0.1％ HgCl2)1ml滅菌6分鐘，用無菌水清洗5次，最后用無菌水重懸后，轉移到潮霉素30mg/L的MS培養基上，使種子在培養基上均勻分布，吸去多余水分，封口膜封口。在擬南芥培養室中，篩選7天。挑選潮霉素抗性分離比為3∶1的株系，用Southern雜交手段挑選單拷貝插入的株系，將單拷貝插入株系的抗性植株移栽到土中。將收到的種子(T3代)通過潮霉素篩選來確定其是否是純合株系，將經過鑒定為純合的株系的種子即T3代在土中播種，以其4-6周正常生長植株為材料，檢測啟動子片段驅動GUS基因表達的情況。
作為擬南芥轉化和GUS表達的陽性對照，以含35S啟動子驅動GUS基因表達的pCAMBIA1301載體轉化擬南芥，得到10株轉基因植株，其中四株用于T3代分析。這四個生長發育正常的株系的植株，在培育室中正常生長四周后從土中拔出，盡量不損壞根部。用水將植株清洗干凈，并用濾紙吸去多余水分，然后將整株植物放于小培養皿中，用X-Gluc染液染色，檢測GUS表達。該四個株系的植株中均檢測到了GUS的表達，且藍色出現在植株的各個部位，包括葉片、葉柄、葉原基、根等。
GUS染色的陰性對照一，即經PBZ處理的處于相同生長時期的野生型擬南芥植株，未檢測到GUS基因的表達。
這些結果表明，擬南芥轉化以及GUS基因表達的檢測系統是可靠、有效的。
以pCGST1、pCGST2、pCGST3轉化擬南芥，分別得到11、9、12株轉基因植株，相應地命名為pCGST1(1)-pCGST1(10)、pCGST2(1)-pCGST2(9)、pCGST3(1)-pCGST3(12)。
對上述轉基因植株株系后代進行PBZ處理3天(水處理作為對照)，然后對整株植株進行GUS表達分析，檢測GUS基因的表達。pCGST1轉化的四個株系中，有3個顯示GUS表達，表達只出現在整個葉片和部分根部。pCGST2、pCGST3轉化得到的部分轉基因株系表現出的組織定位類似，但表達強度明顯不同。
用PBZ處理pCGST1、pCGST2、pCGST3轉化得到的轉基因株系后代植株，以水處理作為對照，3天后取充分展開葉片進行GUS酶活性的定量分析。結果顯示，不同的串連元件重復表現出酶活的梯度，但酶活的大小與元件的多少并不呈現正線性相關，且其本底表達量隨元件串連的數目增加也同時表現出增加的趨勢，其中pCGST2表現出最佳的PBZ誘導活性。
在陰性對照二中，即轉含基本啟動子驅動GUS表達的載體的轉基因植株，能檢測到GUS基因的微量表達，集中于葉柄基部，且其表達不受PBZ處理的影響。
上述結果表明，GST1序列在轉基因擬南芥中可響應PBZ的誘導，并驅動GUS基因的表達，具有可誘導的啟動活性。其整體活性和誘導活性均可通過技術手段進行調節，其中pCGST2表現出較強的整體活性和較低的本底表達，具有最佳的PBZ誘導活性。
本發明涉及的序列SEQ ID No1的信息長度25堿基類型核酸鏈性單鏈拓撲結構線性分子類型寡核苷酸序列描述SEQ ID No1TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACSEQ ID No2的信息長度47堿基類型核酸鏈性單鏈拓撲結構線性分子類型寡核苷酸序列描述SEQ ID No2CTAGATTCTAGCCACCAGATTTGACCAAACACTAGTAAGCTTCTGCASEQ ID No3的信息長度39堿基類型核酸鏈性單鏈拓撲結構線性分子類型寡核苷酸序列描述SEQ ID No3GAAGCTTACTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATSEQ ID No4的信息長度71堿基類型核酸鏈性單鏈拓撲結構線性分子類型寡核苷酸序列描述SEQ ID No4TAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGTGTTTGSEQ ID No5的信息長度132堿基類型核酸鏈性單鏈拓撲結構線性分子類型基因組DNA序列描述SEQ ID No5TAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGTGTTTGGTCAAATCTGGTGGCTAGAATCTAGAGGATSEQ ID No6的信息長度1520堿基類型核酸鏈性單鏈拓撲結構線性分子類型基因組DNA序列描述SEQ ID No61 AAGCTTACAT TCAACGTGTT GCTGCTTCAA AATAAGGGTC TTTACAAAAT TTAAAAAATA
61 TAAAGAAGAA TTTTGAATTT TATAATTAAA GCCGTCAGAA AGGACTTGAC CTTTGAAGCC121 AACCCAACTC AATATTAGAA AATCAAAAAT TTTAGTGCAT TCATTTATAAAAAAAAAAAA181 AATTACTTAT GCAGTTCTTG AACCCTTTGT GAGACGAGAG GGAGTTGCTC GGATGGTAAG241 CACCCTTCAC TTTCAACCCG AAGGTTGCGA GTTTGAGTCA CCAACGGAGC AAAAGGGTA301 GGAGCTCCTA GAAAGGGTAA AAAAAAAAAA AAAAATTAAT AAAAAAATACCCTTTATGAA361 ATTTCTCATT CCGCTACTGC ACTTCTCCCC TGATCTTCCT CGTGTTTTCA ATTATTAATT421 CTATATTCAT GACACCATGT GATGTTTCTC TGGGTAGTCC TAAAAATAGA GGTATTGAAA481 ATTATGTTGT TTCTCTCTGG TCTATTTACT TTTCTTGTGT ACTTTATTGT ATTTCATATT541 GTTAATTTTT GGCTTCGTTT TATAACATGT TATTAGCACA AAACTTTAAT CATATCGAGT601 TAAACTTTTA ATTTTGCTTA TCAACGTAAA AGACAAGATA TGTGATCGGC ATGTATAACT661 ATGTTTTAAT TAGGTATAAT ACATAAATAT TTCCTTTAAT TTTATCTCAT TTTATATTTA721 TGTCGTTTAA CTTTGGAGCG TACAAGTGTC TACTTGTGAT CCAGTAGGTT ATCAAAGCTG781 GCATGCTTAG TTTTACTTTC CAAATTGAAA TTTATATTAG AATTGAATTC AGGAAGAATT841 TTGTAGGTTC AACTAAATTA TATATATATA TATAAAAAAA TAAAAATTAT TAGACGCTTC901 GACTATTTAC TTACTTTAAA ATTTGAATTT TCGTACGAAT AAAATTATTT GTCAGAGAAA961 AGTCTTTTAG CTATTCACAT GCTAGGAAGT TTCACTTTTG GTGGATCAGT GATTGTATAT1021 TATTTAATAT ATATCAATTT TCTCATCAAA CTGAAAATGA AAGATAAAATTAATATTAAA1081 AACTCCATTC ATTTTAATTT ATTGTCATGT TTTGACTTGA TCCAAAATCT AACAATTTAA1141 AAGGTTTTAA ATTTTTGTGC TTTTTTTTAA ATTAAAAATA TGTCAAATAT ATTAAAATAT1201 ATTTTTTAAA TTTTATACTA AAAAACATGT CACATGAATA TTTGAAATTA TAAAATTATC1261 AAAAATAAAA AAAGAATATT TCTTTAACAA ATTAAAAATG AAAATATGATAAATAAATTA1321 AACTATTCTA TCATTGATTT TTCTAGCCAC CAGATTTGAC CAAACAGTGGGTGACATGAG1381 CACATAAGTC ATCTTTATTG TATTTTATTA CTCACTCCAA AAATATAGGG AATATGTTTA1441 CTACTTAATT TAGTCAAATA TAATTTTATA TTAGAATAAT TGAATAGTCAAACAAGAAAC1501 TTTAATGCAT CCTTATTTTT
權利要求
1.一種受化合物烯丙異噻唑誘導的順式元件，其特征在于是一個源于馬鈴薯、且對PBZ的誘導作出應答的順式作用元件，其核苷酸序列為SEQ ID No.1，記為Gst1-box。
2.一重組載體，其特征在于該載體含有權利要求1所述的順式元件Gst1-box或其順式串連構成的啟動子，該載體轉化后的植物中，包含所述核酸啟動子片段、與該啟動子相連的編碼特定基因的DNA順序及合適的3’下游序列，使轉化該重組載體后的植物在有化合物烯丙異噻唑或其活性代謝物的作用下，特定基因產物水平上升；其中所選擇的基因為編碼GUS的基因。
3.一種用權利要求2所述的DNA結構轉化的植物，這種轉基因植物用化合物烯丙異噻唑或其活性代謝物處理引起編碼選擇的基因產物的DNA順序表達增高，該DNA順序經操作連接在所述啟動子片段的3’端。
4.一種由權利要求3所述的轉基因植物的種子。
5.一種在植物中引起所選擇的基因產物表達增高的方法，其特征在于具體如步驟如下a)用上述描述的重組DNA結構轉化植物；b)用化合物烯丙異噻唑或其活性代謝物處理轉基因植物；c)使轉基因植物在期望的時候增加所選擇的基因產物的表達。
全文摘要
本發明屬基因工程技術領域，具體涉及一種分離和利用核酸的順式元件，該元件來源于馬鈴薯中具抗病抗逆作用的基因上游的啟動子序列。將編碼所希望的目的產物基因的核苷酸序列和單元件或其順式串連重復后融合得到重組DNA，用這種重組DNA轉化植物，將得到新的轉基因植物。在新的植物中該重組DNA中的目的基因的表達受烯丙異噻唑probenazole(3－allyloxy－1，2－benzisothiazole－1，1－dioxide，PBZ)或其活性代謝物1，2－benzisothiazole－1，1－dioxide(BIT)的化學誘導物調控。
文檔編號C12N15/82GK1974771SQ20061014725
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月14日 優先權日2006年12月14日
發明者蒯本科, 楊進孝, 高炯, 周茜, 余進 申請人:復旦大學