專利名稱：提高催化劑催化效能的微孔凝膠顆粒固定化細胞的方法
ft術領域 提高催化劑催化效能的微孔凝膠顆粒同定化細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高催化劑中傳質效率和胞內酶活性等催化效能的微孔凝膠顆粒固定化 細胞的制備方法。
背景技術：
PVA能形成良好的凝膠，常用于細胞包埋固定化，其應用中常用的有PVA冷凍法，PVA 化學交聯法，PVA輻射交聯法，國內外在這些方面有大量報道。PVA化學交聯法和PVA輻 射交聯法或是容易開聯，或是對細胞有毒性而在實際應用時受到一定限制。本發明是PVA應 用的物理方法，即PVA冷凍法，凝膠成型利用PVA在0。C -4(TC冷凍適當的時間PVA鏈間 的氫鍵和微晶區形成三維網絡，從而形成物理交聯的PVA水凝膠，且該凝膠具有一定的力學 強度，常溫下在水中只會溶脹而不會溶解。
本發明中所用粘土有蒙脫石、凹凸棒等，其共同特征為具有納米形態，比表面積較大， 吸附性能良好，化學反應活性良好，是優良的載體材料。
海藻酸鈉固定化細胞因其操作簡便、細胞毒性較小等優點而廣泛應用。但其缺點是海藻 酸鈣在磷酸緩沖液及中不穩定，脫鈣使得結構松散而坍塌。本發明正是利用海藻酸鈣凝膠對 磷酸鹽溶液或其它鈣離子絡合劑化學侵蝕的敏感性，通過化學侵蝕將已固定化細胞的含海藻 酸鈣凝膠中的海藻酸鹽部分溶解，從而在原來的凝膠中形成空穴，達到致孔的目的，以提高 在用固定化細胞為催化劑進行生物催化反應時原料和產物的傳輸效率。
國內外凝膠固定化成型后的形狀常為透鏡狀(傳質較好，細胞載量低)及球狀(粒徑較 大，傳質較差，細胞載量較低)。本發明最后成型的包埋了細胞的微孔凝膠為不規則細小顆粒。 制粒采用制藥工藝中常用的濕法制粒，操作簡單方便，易得。顆粒大小均勻，粒徑可控，形 狀為類圓形，干細胞載量可達50%，且傳質性能有較大提高。
用CTAB對微生物細胞進行透性化處理是提高細胞用于生物催化反應時細胞催化能力的 有效方法。本發明在固定化了細胞后，又進行細胞的透性化，提高了胞內酶的活性。而常見 的細胞固定化是沒有進行過透性化處理的。

發明內容
本發明的目的在于提供一種采用PVA-粘土-海藻酸鈉等材料制備微孔凝膠顆粒固定化細胞的方法，用以提高催化劑中傳質效率和胞內酶活性等催化效能。廣泛用于包埋各種細胞。 為了實現上述目的，本發明利用了PVA-粘土-海藻酸鈉包埋細胞的方法，包括濕法制粒、
化學固化、物理固化、脫轉致孔、CTAB透性化處理等五個主要步驟。即首先將一定量的濕 態細胞或干粉狀細胞與適量的粘土混合，再加入適量的PVA水溶液和海藻酸鈉溶液，制粒。 混合均勻后，將顆粒投入適當濃度的CaCl2溶液中。經過適當固化時間，取出顆粒洗滌后， 將表面吹干，立即凍融；解凍后的顆粒置于適當濃度的磷酸鹽溶液或其它鈣離子絡合劑中脫 鈣，再經洗滌即得包埋了細胞的微孔凝膠催化劑，最后通過透性化處理可進一步提高胞內酶 活性而增強催化效力。
利用本發明可獲得不同粒徑的微孔凝膠，且其顆粒及微孔分布較均勻，通透性、機械強 度、細胞載量均良好。經掃描電鏡觀察，利用本發明所得顆粒表面有PVA的網格狀纖維。
利用本發明獲得的微孔凝膠顆粒包埋的細胞在低溫下能長期保存，在生物催化反應中能 長期反復使用。這將有利于生物催化技術在生物催化及生物轉化工業領域中的廣泛應用。 具體實施事例
實例一
將1g面包酵母與3g凹凸棒攪拌混合，再加入5%PVA水溶液2ml， 2%海藻酸鈉溶液 2ml， 一邊振蕩一邊攪拌，直至形成細小的顆粒，過篩，即得所要的顆粒。將顆粒投入20ml 4。/。Cacl2溶液中，輕輕攪拌，使其充分固化。5分鐘后，過濾，并用純化水洗滌兩次。在溫 和冷風條件下將顆粒表面吹干，隨即放在-2(TC的冰柜中冷凍。18小時后，取出顆粒，在室 溫下解凍1小時。如此反復2次即可。將解凍的顆粒投入15ml pH=7 1mol/L磷酸緩沖液中 在3CTC， 120rpm條件下振蕩。4小時后，過濾，洗滌后即得包埋了細胞的微孔凝膠。最后 用0.5XCTAB 100ml進行透性化處理10min，以提高固定化細胞的酶活性,洗漆后，即得包 埋了透性4fc細胞的微孔凝膠顆粒，粒徑500 700|jm。
實例二
將1g啤酒酵母與2.5g蒙脫石攪拌混合，再加入8%PVA水溶液2ml， 2%海藻酸鈉溶液 2ml， 一邊振蕩一邊攪拌，直至形成細小的顆粒，將顆粒投入20ml4y。Cacl2溶液中，輕輕攪 拌，使其充分固化。10分鐘后，過濾，并用純化水洗滌兩次。在溫和冷風條件下將顆粒表面 吹干，隨即放在-2(TC的冰柜中冷凍。18小時后，取出顆粒，在室溫下解凍1小時。如此反 復2次即可。將解凍的顆粒投入15ml 1mol/L磷酸緩沖液中在30°C， 120rpm條件下振蕩。3小時后，過濾，洗滌后即得包埋了細胞的微孔凝膠。最后用O.1XCTAB100ml進行透性化處 理30min，以提高固定化細胞的酶活性，洗滌后，即得包埋了透性化細胞的微孔凝膠顆粒，粒 徑700 900)jm。
權利要求
1、一種提高催化劑中傳質效率和胞內酶活性等催化效能的微孔凝膠顆粒固定化細胞方法，其主要步驟為a)濕法制粒將一定量的細胞與適量的粘土混合，再加入適量的PVA水溶液和海藻酸鈉溶液，攪拌，振蕩，使之成為細小的顆粒。b)化學固化將顆粒投入適當濃度的CaCl2溶液中，經過適當的時間固化后，取出顆粒，洗滌；c)物理固化將洗滌后的顆粒表面吹干，隨即凍融。再反復凍融；d)脫鈣致孔將解凍后的顆粒置于適當濃度的磷酸緩沖液中，脫鈣后經洗滌即得包埋了細胞的微孔凝膠顆粒。e)透性化將上述包埋了細胞的類球形顆粒，在十六烷基三甲基溴化胺溶液(CTAB)中，在4℃左右處理近10min，以使固定化細胞透性化。形成微孔凝膠顆粒固定化細胞的液體環境所述PVA水溶液在0.01％～15％(W/V)；所述海藻酸鈉濃度在0.01％～6％(W/V)；所述CaCl2溶液濃度在0.1％～20％(W/V)；所述的磷酸緩沖液pH在4～10，濃度為0.1～1mol/L；透性化處理所用CTAB溶液為0.01％到5％；透性化時間為1～60分鐘。
2、 按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟a)中所述的細胞為酵母或其它真菌細 胞，或細菌和基因工程改造過的微生物細胞等，質量分數5% 50%;粘土為蒙托石和凹凸 棒等無機材料，其質量分數在1% 50%。
3、 按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b)中所述的顆粒粒徑為50 3000|jm; 最佳狀態為500 1000|jm，固化時間為10秒~60分鐘。
4、 按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟c)中所述的凍融條件為-4(TC 0'C， 1 10次，每次1 24小時。
5、 按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟d)中所述進行脫鈣的作用時間為10分 鐘 8小時。
6、 按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟d)中利用海藻酸鈣凝膠對磷酸鹽溶液 或其它鈣離子絡合劑化學侵蝕的敏感性，通過化學侵蝕將已固定化細胞的含海藻酸鈣凝膠中的海藻酸鹽部分溶解，從而在原來的凝膠中形成空穴，以提高在用固定化細胞為催化劑進行 生物催化反應時原料和產物的傳輸效率。
7、 按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟e)中，將已經用凝膠固定化后的細胞 用CTAB進行透性化處理，從而提高細胞內的酶活性、應用過程中原料和產物進出細胞的速 度。
8、 按照權利要求1所述的方法，其特征在于經過要求1中所述的步驟從a)到d)后， 還可以用聚乙烯醇重新再包被所得到的顆粒，并再次凍融；最后再進行要求1中步驟e)所 述的用CTAB進行透性化處理。
全文摘要
一種采用PVA-粘土-海藻酸鈉等材料制備微孔凝膠顆粒固定化細胞的方法，用以提高催化劑中傳質效率和胞內酶活性等催化效能。制備凝膠的過程中，采用了制藥工藝中常見的濕法制粒，可制得500μm～1000μm的顆粒；運用海藻酸鈉-氯化鈣法化學固定化細胞，PVA凍融法物理固定化細胞增加了顆粒的機械強度；在磷酸鹽溶液或其它鈣離子絡合劑中化學侵蝕海藻酸鈣從而脫鈣致孔，提高了傳質效率；再用CTAB透性化細胞，搞高胞內酶的活性。本發明制備過程中條件溫和，對細胞活性無損害。制得的顆粒均勻，且細胞載量較高，泄漏率低于10％。
文檔編號C12N11/04GK101532006SQ20081006945
公開日2009年9月16日 申請日期2008年3月12日 優先權日2008年3月12日
發明者于明安, 毅 侯, 飛 廖, 楊曉蘭, 泉 趙, 巍 陸, 龔耿浩 申請人:重慶醫科大學