專利名稱：一種直投式紅茶菌發酵劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種直投式紅茶菌發酵劑的制備方法，屬于生物工 程或食品工程領域。
技術背景-
紅茶菌又名"海寶"、"胃寶"，用紅茶水泡養紅茶菌可得到含 有乳酸、茶多酚、維生素等多種天然營養物質的飲料，研究發現，紅 茶菌在改善胃腸道功能、抗癌、抗菌、免疫等方面均有不俗的表現。 但其至今沒能形成大規模工業推廣。究其具體原因有以下幾點
1、 對紅茶菌保健性能研究不夠透徹-
有關紅茶菌保健功能和安全性的研究報道在國內很少，只有陳喧 等人報道了茶葉和紅茶菌中的有效成分對人體腸道生態平衡的作用， 即葡萄糖二酸l， 4內酯及葡萄糖酸對人體有抑菌，解毒、抗癌的作用。
國外Anita M.Hartman等利用小鼠長期飲用紅茶菌對生長壽命、食欲 變化、器官等進行跟蹤比較發現，對照組各方面均比飲用組差。這說 明紅茶菌飲料的確有一定保健功效。
2、 對于紅茶菌的菌種及菌種組合的優勢群體的研究還未展
開
對紅茶菌粒中的微生物研究，僅限于分離純化和鑒定。AiLengTeoh 對紅茶菌發酵飲料中的微生物進行了詳細的研究，利用氧四環素作 為抑制細菌生長的物質，對紅茶菌發酵中的菌膜和液體基質中的酵 母菌分離，得到了布魯克絲假絲酵母(C andidacrusei)、栗酒裂殖 酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克勒克酵母(K loeckem)、拜 耳結合酵母(Zygosaccharomycesbailii) 。 Safak， S等從發酵紅茶 菌中分離得到11種酵母菌，其中8株為釀酒 (Saccharomycescerevisiae) ，2株為克魯假絲酵(Candidacrusei)， 1株Kluyveromyce safricanus，但目前還沒有學者系統的做過紅茶 菌菌種組合的優勢群體的研究。
3 、 沒有擺脫傳統工藝的局限性
傳統紅茶菌飲料生產中，由于發酵用紅茶菌為膜狀結構，具有 繁殖能力，且菌相互生關系和菌相比例系不是恒定不變的，處于變 化狀態，易受外界環境影響，易受污染，影響正常發酵，它存在著 易變、不易控制，菌膜的回收清洗不方便、發酵性能不穩定等缺點。

發明內容
本發明的目的在于克服上述已有技術的不足而提供一種操作簡 單，培養周期短，含菌體數量高、發酵能力強，可以實現紅茶菌飲 料生產的工業化推廣的直投式紅茶菌發酵劑的制備方法。
本發明的目的可以通過如下措施來達到 一種直投式紅茶菌發 酵劑的制備方法，其特征在于其包括如下步驟
a、 將酵母菌接入酵母菌液體培養基中，靜置培養，溫度2(TC-25 °C，培養1-3天，離心收獲菌體并用無菌水洗滌至少一次；
b、 將醋酸菌接入醋酸菌液體培養基中，旋轉式搖床，轉速220rpm; 溫度25'C-35°C，培養1-3天，離心收獲菌體并用無菌水洗滌至少一 次；
c、 將乳酸菌接入乳酸菌液體培養基中，旋轉式搖床，轉速220rpm; 溫度35"C-40°C，培養1-3天，離心收獲菌體并用無菌水洗滌至少一 次；
d、 將離心收獲的酵母菌菌體和醋酸菌菌體和乳酸菌菌體等比例 混合，接種至紅茶菌培養液中，旋轉式搖床，轉速150rpm;溫度25 °C-35°C，培養l-2天；
e、 配制濃度為3%-8%的海藻酸鈉溶液，110°C-130。C滅菌 20-30min;配制濃度為0. 05%-18%的CaCl2溶液，110。C-130。C滅菌 20-30min，將步驟4得到的含菌培養液與海藻酸鈉溶液等積混合后， 滴入CaCl2溶液中；
f、將步驟e得到的含菌凝膠球置于CaCl2溶液中，2-6r靜置12-36 小時即制得直投式紅茶菌發酵劑。
為了進一步實現本發明的目的，所述的酵母菌為釀酒酵母或巴斯 德酵母中的至少一種。
為了進一歩實現本發明的目的，所述的酵母菌液體培養基為馬鈴 薯葡萄糖培養基(PDA培養基)或麥芽汁培養基。
為了進一步實現本發明的目的，所述的醋酸菌為醋化醋桿菌木質 亞種、葡萄糖醋桿菌、產酮醋桿菌、弱氧化醋桿菌、巴氏醋桿菌中的 至少一種。
為了進一步實現本發明的目的，所述的乳酸菌為雙歧桿菌、保加 利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳酸菌、干酪乳桿菌中的至少一種。
為了進一步實現本發明的目的，所述的乳酸菌液體培養基為BCG 培養基或Ml 7培養基或MRS培養基或TJA培養基。
為了進一步實現本發明的目的，所述的紅茶菌培養液采用重量比 為5%-25%的糖，0.2-5%的茶，水余量，將水燒沸，沸水冷卻至85。C 90。C時，加入茶，保溫20min,濾去茶渣，然后在茶液中加入蔗糖混 勻制得。本發明同已有技術相比可產生如下積極效果
本發明人經過廣泛而深入細致的研究，掌握了紅茶菌菌相的構成 以及互生關系，通過對分離得到的優勢菌種反復組合，終于篩選出可 直接組合用于生產直投式紅茶菌發酵劑的菌株。所選菌株均為人們熟 知的益生菌，對人體無毒無害安全穩定，且具有相當的保健功效。通 過海藻酸鈉包埋固定化處理，將混合培養后的五種菌體混合物制成可 直接用于生產的含菌凝膠珠即直投式發酵劑。在此基礎上對直投式紅 茶菌發酵劑生產工藝進行了改進和完善，從而完成了本發明。
本發明根據紅茶菌的菌相組成，采用一般液體培養基，培養發 酵性能和互生關系較好的益生菌醋化醋桿菌木質亞種"Ce&^3^er
xy2j'/7t/范)、保加利亞乳桿菌Uac"6acteri'i/zz Ai/7a^ricw^ 、雙歧桿 菌(^j'/!z'c/afecten'〃/^ 、酉良酒酵母(5^cc力aroyz7yces1 ce"reFis7'ae)、 巴斯德酵母(5"acc/ ara,ce5" / as"tor2'朋W5" Zfe/ s"e/j )， 收獲菌體, 然后在紅茶菌發酵液中混合培養，使其達到平衡，然后加入到一定 的海藻酸鈉溶液中，滴入一定濃度的氯化鈣溶液，得到可直接用于 工業化生產的直投式紅茶菌發酵劑。其外觀為凝膠珠形式。本發明 產品在生產過程中可以直接接種，無須中間繼代培養過程，使用方 便，發酵產品質量穩定，尤其是海藻酸鈉包埋得到的凝膠珠可反復 使用達三個月以上，是一類新型商品化生產菌種。本發明可以方便、 簡單的生產直投式紅茶菌發酵劑，具有工藝簡單、生產周期短，產 量高、效果明顯等優點，整個生產過程中無污染無廢棄物，所需物 質可反復利用，成本低廉。其次，以本發明提供的方法生產出的直 投式紅茶菌發酵劑解決了傳統紅茶菌飲料生產中菌相比例不固定、 菌膜的回收清洗不方便、發酵性能不穩定等缺點，該方法操作簡單， 含菌體數量高、發酵能力強。此外，以該方法提供的直投式紅茶菌 發酵劑，可以生產出安全穩定且具有相當保健功能的紅茶菌飲料， 有助于實現紅茶菌飲料生產的工業化推廣，有較強的實用性。
具體實施例方式下面對本發明的具體實施方式
作詳細說明
1、 菌種
醋酸菌醋化醋桿菌木質亞種；也可采用葡萄糖醋桿菌、產酮 醋桿菌、弱氧化醋桿菌、巴氏醋桿菌等其它同類醋酸菌。
乳酸菌保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌；也可采用嗜熱鏈球菌、 嗜酸乳酸菌、干酪乳桿菌等其它同類乳酸菌。
酵母菌巴斯德酵母、釀酒酵母；也可采用其它同類酵母菌。
2、 制備菌種培養基 酵母菌液體培養基
可采用已有的馬鈴薯淀粉培養基和麥芽浸膏培養基，也可采用按下述方法制得的馬鈴薯淀粉培養基將馬鈴薯洗凈去皮后，切成 小塊，稱取200g，加水200g，煮沸30min，加水定容至1L，用雙層 紗布過濾，加入20g蔗糖和20g瓊脂于濾液中，煮沸，待蔗糖和瓊 脂完全溶解后，補加蒸發損失的水分至1L混勻，以100ml/瓶分裝到 250ml三角瓶中，于110°C-130。C滅菌20-30min。
醋酸菌液體培養基可采用已有的醋酸菌液體培養基，也可采 用按下述方法制得的醋酸菌液體培養基葡萄糖30g，酵母提取物 5.0g，蛋白胨3g,碳酸鈣10g，加水定容至1000mL。以100ml/瓶分 裝到250ml三角瓶中，110°C-121。C滅菌10-25min。
乳酸菌培養基
可采用已有的乳酸菌培養基(BCG培養基或M17培養基或MRS 培養基等)，也可采用按下述方法制得的乳酸菌培養基(TJA培養基) 番茄汁50g，酵母抽提液5. Og，牛肉膏10g，乳糖20g，葡萄糖2. Og， 磷酸氫二鉀2. Og,吐溫-80 1. Og，乙酸鈉1. Og，蒸餾水1000 mL， pH6.8左右。先將番茄洗凈放入打漿機中打碎，過濾，濾液備用。將 上述酵母抽提液、牛肉膏、乳糖、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉置 于1000mL燒杯中，加水完全溶解后，加溫至沸，然后加入番茄汁和 吐溫，攪勻，補足水分到1000 mL，調節pH值至6. 8。以100m1/ 瓶分裝到250ml三角瓶中，110。C-12rC滅菌10-25min。
3、器材10ml注射器外套及5#頭皮靜脈針，100ml三角燒瓶(無 菌)，50ml帶蓋離心管(無菌)。20 22。C及37。C水浴，水平式 離心機，旋轉式搖床。
實施例1:
將巴斯德酵母和釀酒酵母接入上述酵母菌液體培養基中，靜置培 養，溫度22'C，培養2天，離心收獲菌體并用無菌水洗滌兩次；
將醋化醋桿菌木質亞種接入上述醋酸菌液體培養基中，旋轉式搖 床，轉速220rpm;溫度3CTC，培養2天，離心收獲菌體并用無菌水 洗滌兩次；
將保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌接入上述乳酸菌液體培養基中，旋 轉式搖床，轉速220rpm;溫度37°C，培養2天，離心收獲菌體并用 無菌水洗滌兩次；
制備紅茶菌培養液取蔗糖150g,普洱茶20g，水830g，將水 燒沸，沸水冷卻至85。C 9(TC時，加入茶，保溫20min，濾去茶渣， 然后在茶液中加入蔗糖混勻，分裝至500mL三角瓶中，牛皮紙包扎 后，進行巴氏滅菌，冷卻至室溫備用。
海藻酸鈉溶液總重量50g，其中5%的海藻酸鈉，水余量，121 。C滅菌25min ， 4'C存放。CaCl2溶液總重量1000g，其中無水CaCl2l096,水余量，p朋 8， 12rC滅菌25min ， 4。C存放。 CaCl2溶液。
取將離心收獲的酵母菌菌體和醋酸菌菌體和乳酸菌菌體各O. 5g 混合，接種至紅茶菌培養液中，旋轉式搖床，轉速150rpm;溫度30 。C，培養1.5天；
將CaCl2溶液移入三角瓶中，12rC滅菌25min，將頭皮靜脈針通 過三角燒瓶口的棉塞伸入三角瓶內，并與10ml注射器連接。將此浸入 37t:水浴鍋中10min。
將上述含菌培養液與海藻酸鈉溶液等積混合(海藻酸鈉菌體混懸 液)移入注射器中，適度加力，將海藻酸鈉菌體混懸液滴入CaCl2溶 液中。
滴完，將三角瓶移入20 22'C水浴放置lh。傾去溶液，加入100ml 無菌去離子水沖洗l次。得到的含菌凝膠球重新置于CaCl2溶液中，4 'C靜置24小時，制得直投式紅茶菌發酵劑。
實施例2:
將巴斯德酵母接入上述酵母菌液體培養基中，靜置培養，溫度20 °C，培養1天，離心收獲菌體并用無菌水洗滌一次；
將葡萄糖醋桿菌和產酮醋桿菌接入上述醋酸菌液體培養基中，旋 轉式搖床，轉速220rpm;溫度25°C，培養1天，離心收獲菌體并用 無菌水洗滌一次；
將嗜熱鏈球菌、嗜酸乳酸菌接入上述乳酸菌液體培養基中，旋轉 式搖床，轉速220rpm;溫度35°C，培養1天，離心收獲菌體并用無 菌水洗滌一次；
制備紅茶菌培養液取蔗糖50g，龍井茶2g，水948g,將水燒沸， 沸水冷卻至85。C 9(TC時，加入茶，保溫20min，濾去茶渣，然后在 茶液中加入蔗糖混勻，分裝至500mL三角瓶中，牛皮紙包扎后，進行 巴氏滅菌，冷卻至室溫備用。
海藻酸鈉溶液總重量50g，其中3%的海藻酸鈉，水余量，110 。C滅菌20min ， 2。C存放。
CaCl2溶液總重量1000g其中無水CaCl2 0. 05%,水余量，p朋 8， 110。C滅菌20min 。
取將離心收獲的酵母菌菌體和醋酸菌菌體和乳酸菌菌體各O. 5g 混合，接種至紅茶菌培養液中，旋轉式搖床，轉速150rpm;溫度25 °C，培養l天；
將CaCl2溶液移入三角瓶中，110。C滅菌20min，將頭皮靜脈針通 過三角燒瓶口的棉塞伸入三角瓶內，并與10ml注射器連接。將此浸入37"C水浴鍋中10min。
將上述含菌培養液與海藻酸鈉溶液等積混合(海藻酸鈉菌體混懸 液)移入注射器中，適度加力，將海藻酸鈉菌體混懸液滴入CaCl2溶 液中。
滴完，將三角瓶移入20 22t:水浴放置lh。傾去溶液，加入 100ml無菌去離子水沖洗1次。得到的含菌凝膠球重新置于CaCl2溶 液中，2-C靜置12小時，制得直投式紅茶菌發酵劑。
實施例3:
將巴斯德酵母、釀酒酵母接入上述酵母菌液體培養基中，靜置培 養，溫度25。C，培養3天，離心收獲菌體并用無菌水洗滌至少一次；
將醋化醋桿菌木質亞種、弱氧化醋桿菌、巴氏醋桿菌接入上述醋 酸菌液體培養基中，旋轉式搖床，轉速220rpm;溫度35°C，培養3 天，離心收獲菌體并用無菌水洗滌三次；
將干酪乳桿菌接入上述乳酸菌液體培養基中，旋轉式搖床，轉速 220rpm;溫度4(TC，培養3天，離心收獲菌體并用無菌水洗滌3次； 制備紅茶菌培養液取蔗糖250g，普洱茶50g，水700g，將水燒 沸，沸水冷卻至85'C 9(TC時，加入茶，保溫20min，濾去茶渣，然 后在茶液中加入蔗糖混勻，分裝至500mL三角瓶中，牛皮紙包扎后， 進行巴氏滅菌，冷卻至室溫備用。
海藻酸鈉溶液總重量50g，其中8%的海藻酸鈉，水余量，130 。C滅菌30min ， 6。C存放。
CaCl2溶液總重量1000g其中無水CaCl2 18%，水余量，pH6 8， 130。C滅菌30min 。
取將離心收獲的酵母菌菌體和醋酸菌菌體和乳酸菌菌體各O. 5g 混合，接種至紅茶菌培養液中，旋轉式搖床，轉速150rpm;溫度35 °C，培養2天；
將CaCl2溶液移入三角瓶中，13(TC滅菌30min，將頭皮靜脈針通 過三角燒瓶口的棉塞伸入三角瓶內，并與10ml注射器連接。將此浸入 37"C水浴鍋中10min。
將上述含菌培養液與海藻酸鈉溶液等積混合(海藻酸鈉菌體混懸 液)移入注射器中，適度加力，將海藻酸鈉菌體混懸液滴入CaCl2溶 液中。
滴完，將三角瓶移入20 22。C水浴放置lh。傾去溶液，加入100ml 無菌去離子水沖洗2次。得到的含菌凝膠球重新置于CaCl2溶液中，6 。C靜置36小時，制得直投式紅茶菌發酵劑。
權利要求
1、一種直投式紅茶菌發酵劑的制備方法，其特征在于其包括如下步驟a、將酵母菌接入酵母菌液體培養基中，靜置培養，溫度20℃-25℃，培養1-3天，離心收獲菌體并用無菌水洗滌至少一次；b、將醋酸菌接入醋酸菌液體培養基中，旋轉式搖床，轉速220rpm；溫度25℃-35℃，培養1-3天，離心收獲菌體并用無菌水洗滌至少一次；c、將乳酸菌接入乳酸菌液體培養基中，旋轉式搖床，轉速220rpm；溫度35℃-40℃，培養1-3天，離心收獲菌體并用無菌水洗滌至少一次；d、將離心收獲的酵母菌菌體和醋酸菌菌體和乳酸菌菌體等比例混合，接種至紅茶菌培養液中，旋轉式搖床，轉速150rpm；溫度25℃-35℃，培養1-2天；e、配制濃度為3％-8％的海藻酸鈉溶液，110℃-130℃滅菌20-30min；配制濃度為0.05％-18％的CaCl2溶液，110℃-130℃滅菌20-30min，將步驟4得到的含菌培養液與海藻酸鈉溶液等積混合后，滴入CaCl2溶液中；f、將步驟e得到的含菌凝膠球置于CaCl2溶液中，2-6℃靜置12-36小時即制得直投式紅茶菌發酵劑。
2、 根據權利要求1所述的一種直投式紅茶菌發酵劑的制備方法， 其特征在于所述的酵母菌為釀酒酵母或巴斯德酵母中的至少一種。
3、 根據權利要求1所述的一種直投式紅茶菌發酵劑的制備方法， 其特征在于所述的酵母菌液體培養基為馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA培 養基)或麥芽汁培養基。
4、 根據權利要求1所述的一種直投式紅茶菌發酵劑的制備方法， 其特征在于所述的醋酸菌為醋化醋桿菌木質亞種、葡萄糖醋桿菌、產 酮醋桿菌、弱氧化醋桿菌、巴氏醋桿菌中的至少一種。
5、 根據權利要求1所述的一種直投式紅茶菌發酵劑的制備方法， 其特征在于所述的乳酸菌為雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、 嗜酸乳酸菌、干酪乳桿菌中的至少一種。
6、 根據權利要求1所述的一種直投式紅茶菌發酵劑的制備方法， 其特征在于所述的乳酸菌液體培養基為BCG培養基或M17培養基或 MRS培養基或TJA培養基。
7、 根據權利要求1所述的一種直投式紅茶菌發酵劑的制備方法， 其特征在于所述的紅茶菌培養液采用重量比為5%-25%的糖，0.2-5% 的茶，水余量，將水燒沸，沸水冷卻至85"C 90'C時，加入茶，保溫 20min，濾去茶渣，然后在茶液中加入蔗糖混勻制得。
全文摘要
本發明公開了一種直投式紅茶菌發酵劑的制備方法，其特征在于其包括如下步驟將離心收獲的酵母菌菌體和醋酸菌菌體和乳酸菌菌體等比例混合，接種至紅茶菌培養液中培養后與海藻酸鈉溶液等積混合后，滴入CaCl₂溶液中，得到的含菌凝膠球置于CaCl₂溶液中，靜置即制得直投式紅茶菌發酵劑，本發明具有生周期短、產量高、無廢棄物等優點，以該發明生產出的直投式紅茶菌發酵劑，解決了傳統紅茶菌在工業化生產中菌相易變、工藝復雜的問題，為紅茶菌飲料的工業化生產提供了可靠途徑。并且由于該發明中使用的菌種均為對人體無毒害的確切益生菌，可用該產品生產出保健性和安全性均有保障的功能飲料。
文檔編號C12N11/10GK101560512SQ20091001502
公開日2009年10月21日 申請日期2009年4月30日 優先權日2009年4月30日
發明者睿 張 申請人:睿 張