專利名稱：有毒甲藻規(guī)模化生產(chǎn)的采收方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藻類采收領(lǐng)域，具體涉及一種有毒甲藻規(guī)模化生產(chǎn)的采收方法。
背景技術(shù)：
海洋甲藻(dinoflagellate)，又稱海洋雙鞭藻，是主要的海洋赤潮生物之 一，甲藻產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物，又稱甲藻毒素。研究表明，甲藻毒素在開 發(fā)抗癌、鎮(zhèn)痛、麻醉、抗病毒、抗菌等各種治療藥以及作為癌癥等藥理研究工 具藥方面有著非常廣闊的應(yīng)用前景。
由于自然環(huán)境中有毒甲藻的細(xì)胞密度非常低，因而毒素原材料的來源困難 制約了毒素的進(jìn)一步深入研究和應(yīng)用，目前國際市場上毒素種類較少，價格昂 貴。甲藻毒素的分子量往往較大，很難進(jìn)行仿生有機(jī)合成，因此從天然環(huán)境中 分離有毒甲藻獲得純系進(jìn)行高密度高毒性的規(guī)模化培養(yǎng)，收集有毒甲藻藻泥用 于分離提取各種毒素成為目前最為常用的途徑。
在有毒甲藻的規(guī)模化生產(chǎn)過程中，安全高效完整地采收甲藻細(xì)胞，防止 細(xì)胞破裂造成內(nèi)容物外泄，是分離提取各種毒素的前提和保證。
有毒甲藻為單細(xì)胞，個體大小通常在幾十微米，最小的只有幾微米，絕大 多數(shù)種類具有由許多小甲片組成的細(xì)胞壁，其生活方式為游動的單細(xì)胞或由單 細(xì)胞連成各種形狀的群體。海洋中能產(chǎn)生毒素的甲藻約有45-60種，但迄今能 夠?qū)崿F(xiàn)人工規(guī)模化培養(yǎng)的只有寥寥數(shù)種。甲藻的種類不同，生活方式不同，采 收方法也不同。中國專利200510034502提供了一種單細(xì)胞藻類的采收方法，該方法是收 集單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)原液并進(jìn)行粗濾，利用超濾濃縮設(shè)備循環(huán)過濾，得到所需 濃度的單細(xì)胞藻類濃縮劑，濃縮后液再進(jìn)行常規(guī)處理，該方法雖然可以實(shí)現(xiàn)單 細(xì)胞藻類的采收，但是過濾步驟復(fù)雜，對多個工藝條件需要控制，而且采收過 程中需要過濾器等儀器，還需要清洗過濾器。
本發(fā)明人之前申請的中國專利03146858給出單細(xì)胞有毒甲藻的一個種類 "^4wp/2z^m^m A:/eZw7的純禾中分離途徑，其中提到用對」wp/2zViz>7/ww Hefo"的 采集方法是先向藻液中加入濃度為0.2~0.35質(zhì)量％。的絮凝劑 [KA1(S04)2 12H20],甲藻細(xì)胞沉淀后通過逐級濃縮再用濾膜過濾多余水分 收集藻泥。
本發(fā)明通過繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，雖然上述利用絮凝劑沉淀單細(xì)胞生活的有毒甲 藻，用濾膜過濾收集得到藻泥用于提取各種毒素，不失為一種有效的方法，但 由于有毒甲藻不同的種類細(xì)胞大小不同，活動能力不同，所需的絮凝劑用量也 不同，若絮凝劑用量過小則甲藻細(xì)胞不能沉淀或不能完全沉淀，而用量過大則 容易造成細(xì)胞破裂內(nèi)容物外泄，既污染環(huán)境又達(dá)不到提取毒素的目的；而且， 逐級濃縮后濾膜過濾收集藻泥只適用于水體較小的室內(nèi)養(yǎng)殖，當(dāng)養(yǎng)殖規(guī)模較大 時濾膜容易堵塞，需要經(jīng)常收集清理就顯得既費(fèi)時費(fèi)力又麻煩。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生 產(chǎn)的，可用于采收多種單細(xì)胞甲藻種類，且規(guī)模化生產(chǎn)過程中能保證安全、高 效、無細(xì)胞破損的有毒甲藻的采收方法。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明人通過對有毒甲藻規(guī)模化生產(chǎn)的采收方法進(jìn)行試驗(yàn)摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 將絮凝劑的使用和離心方法結(jié)合起來，可實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，絮凝劑的加入能夠沉 淀單細(xì)胞生活的有毒甲藻細(xì)胞，然后再采用離心方法則可以獲得藻泥。絮凝劑 和離心方法的結(jié)合既可以避免單獨(dú)使用絮凝劑易導(dǎo)致用量過大，細(xì)胞破裂造成 內(nèi)容物甲藻毒素外泄的問題，又解決了規(guī)模化生產(chǎn)中單獨(dú)使用離心法收集的高 投資高能耗問題，而且離心方法的運(yùn)用實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化生產(chǎn)時大批量的采收。
本發(fā)明的有毒甲藻規(guī)模化生產(chǎn)的采收方法，其包括如下步驟
(1) 向有毒甲藻藻液中加入絮凝劑KA1(S04)2 '12H20至KA1(S04)2 '121120 的終濃度為0.2~0.35%。；
(2) 靜置1 2小時后，除去上清水體，收集沉淀液；
(3) 將上述沉淀液離心后，棄去上清液，底部沉淀即為所需藻泥，收集該 藻泥保存即可。
上述步驟(1)中，有毒甲藻的收集一般選擇在甲藻生長至收獲期時進(jìn)行。
上述步驟(1)中，向藻液中加入絮凝劑的時候，可以邊加邊攪拌，使藻 細(xì)胞充分絮凝沉淀。
上述步驟(2)中，將加有絮凝劑的有毒甲藻藻液靜置，在靜置過程中可 用顯微鏡鏡檢上層水體，當(dāng)上層水體中基本無甲藻細(xì)胞檢出時，排去上清水體， 收集沉淀液；如有必要還可以重復(fù)步驟(2)。
上述步驟(3)中，離心的作用是對沉淀液的純化，實(shí)際操作時可采用 2000 3000r/min的轉(zhuǎn)速，離心10~15分鐘，離心后收集底部的沉淀物，即有 毒甲藻的細(xì)胞，將沉淀物放入冰箱凍存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明中對絮凝劑終濃度采用％。單位表示，該單位是"質(zhì)量體積千分比濃度"，即每1000ml水體中含KA1(S04)2 12H20的質(zhì)量數(shù)，如0.2%0的KA1(S 04)2 12H20，就表示1000 ml水體中含0.2g的KA1(S04)2 12H20。
本發(fā)明人針對不同的有毒甲藻種類的細(xì)胞大小不同，活動能力不同，對絮 凝劑的要求用量也不同的問題，還進(jìn)一步地針對有毒甲藻常見的幾個種類進(jìn)行 了絮凝劑用量的研究，在上述絮凝劑KA1(S04)2 12H20的0.2~0.35%。的用量 范圍內(nèi)，提供更有針對性的用量，從而使得有毒甲藻取得更好的采收效果。
當(dāng)有毒甲藻為單庫里亞藻(Coo//a mo朋泡)時，KA1(S04)2 12H20的 用量為0.3 0.35%。；
當(dāng)有毒甲藻為利瑪原甲藻(praracewrWm //ma)時，KA1(S04)2 12H20 的用量為0.2~0.25%。；
當(dāng)有毒甲藻為慢原甲藻(尸rarace"fram r/w^ym"w)時，KA1(S04)2 '121120 的用量為0.2~0.25%。；
當(dāng)有毒甲藻為卡氏前溝藻(也可以稱為強(qiáng)壯前溝藻，p/zWm^m caWerae)時，KA1(S04)2 12H20的用量為0.25 0.3%。；
當(dāng)有毒甲藻為克氏前溝藻"m;^Wm'ww A:/eZw7)時，KA1(S04)2 12H20 的用量為0.2~0.25%。。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1. 本發(fā)明采用絮凝劑和離心兩種方法的結(jié)合，不但解決了現(xiàn)有技術(shù)無法 規(guī)模化生產(chǎn)的問題，而且能夠?qū)崿F(xiàn)安全、高效、無細(xì)胞破碎；
2. 有毒甲藻種類不同，其細(xì)胞大小不同，活動能力不同，本發(fā)明針對不 同種類有毒甲藻，提供恰當(dāng)合適的絮凝劑用量沉淀甲藻細(xì)胞，從而避免了絮凝 劑用量過多細(xì)胞會破裂，其內(nèi)容物甲藻毒素外泄，污染環(huán)境的問題，而且也不會出現(xiàn)絮凝劑用量過少，甲藻細(xì)胞沉淀不下來的問題；
3. 本發(fā)明采用絮凝劑和離心相結(jié)合的方法，既可以避免單獨(dú)使用絮凝劑易
導(dǎo)致用量過大，細(xì)胞破裂造成內(nèi)容物甲藻毒素外泄的問題，又解決了規(guī)模化生
產(chǎn)中單獨(dú)使用離心法收集的高投資高能耗問題，節(jié)約成本；
4. 采用本發(fā)明的方法可獲得充足的藻泥作為原材料制取甲藻毒素；
5. 本發(fā)明只需要通過簡單加入絮凝劑就可以實(shí)現(xiàn)藻類細(xì)胞的沉淀，無需大 型儀器和繁復(fù)的工藝控制，成本低廉，操作簡單；
6. 本發(fā)明在絮凝劑沉淀藻類細(xì)胞后，選擇離心的方法來進(jìn)一步純化得到藻 泥，離心能提高大規(guī)模生產(chǎn)時的純化速度，而且能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)時對大量沉 淀液的純化，而這兩點(diǎn)是過濾方法無法實(shí)現(xiàn)的，絮凝劑和離心兩種方法的結(jié)合 最終得到大量且細(xì)胞完整無破損的藻泥，從而達(dá)到提取活性次生代謝產(chǎn)物(甲 藻毒素)的目的。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但具體實(shí)施例并不對本發(fā)
明做任何限定。
實(shí)施例1 有毒甲藻Ow//a m朋d's的采收 本實(shí)施例有毒甲藻Coo/z'a mo"o^的采收，其具體步驟如下 (1 )待培養(yǎng)水體中有毒甲藻Coo/z'amo"o他生長至收獲期，在藻液中加入
絮凝劑KA1(S04)2 12H20至KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.3質(zhì)量％。，邊
加邊攪拌，使藻細(xì)胞大量沉淀；
(2)靜置2小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細(xì)胞檢出，排去上清
水體，收集沉淀液；(3) 將上述沉淀液以轉(zhuǎn)速2000r/min的離心速度，離心15分鐘，棄去上 清液，底部沉淀即為本實(shí)施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷凍備用。
(4) 對比試驗(yàn)KA1(S04)2 12H20的終濃度低于0.3%。時，顯微鏡下可在 上層水體中檢出零星細(xì)胞，終濃度為0.3 0.35%。時基本無細(xì)胞檢出，KAl(SO 4)2 *12H20的終濃度為1.0%。時有變形細(xì)胞，終濃度至2.5%。時發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞破碎， 基于成本節(jié)約、絮凝劑水體殘留最低以及細(xì)胞完整度等綜合因素考慮，選擇O. 3 0.35%。為KA1(S04)2 12H20的終濃度。
甲藻細(xì)胞具有細(xì)胞壁，為定形細(xì)胞，細(xì)胞變形意味著內(nèi)容物有外泄，細(xì) 胞是否變形、破裂在顯微鏡下可直接觀察到，由此可判斷收集的藻泥其細(xì)胞是 否完整無破裂。
實(shí)施例2 有毒甲藻7Vwvce"加'Mm //iwa的采收 本實(shí)施例有毒甲藻尸rorace"化/wm //ma的采收，其具體步驟如下
(1) 待培養(yǎng)水體中有毒甲藻/Vorace"Wwm /z7wa生長至收獲期，在藻液中 加入絮凝劑KA1(S04)2 12H20至KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.2%。，邊加 邊攪拌，使藻細(xì)胞大量沉淀；
(2) 靜置1小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細(xì)胞檢出，排去上清 水體，收集沉淀液；
(3) 將上述沉淀液以轉(zhuǎn)速2000r/min的離心速度，離心10分鐘，棄去上 清液，底部沉淀即為本實(shí)施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷凍備用。
(4) 對比試驗(yàn)KA1(S04)2 12H20的終濃度低于0.2%。時，顯微鏡下可在 上層水體中檢出零星細(xì)胞，終濃度為0.2 0.25%。時基本無細(xì)胞檢出， KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.8%。時有變形細(xì)胞，終濃度為1.5%。時發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞破碎，基于成本節(jié)約、絮凝劑水體殘留最低以及細(xì)胞完整度等綜合因素考
慮，選擇0.2 0.25%。為KA1(S04)2 12H20的終濃度。
實(shí)施例3 有毒甲藻戶/wvce"fr"附尸/rfl幼戸"附的采收
本實(shí)施例有毒甲藻尸rarace^n/m Aaf/^mwm的采收，其具體步驟如下
(1) 待培養(yǎng)水體中有毒甲藻尸rarace^n/w Aa^ymwm生長至收獲期，在藻 液中加入絮凝劑KA1(S04)2 12H20至KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.25%。， 邊加邊攪拌，使藻細(xì)胞大量沉淀；
(2) 靜置2小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細(xì)胞檢出，排去上清 水體，收集沉淀液；
(3) 將上述沉淀液以轉(zhuǎn)速2000r/min的離心速度，離心15分鐘，棄去上 清液，底部沉淀即為本實(shí)施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷凍備用。
(4) 對比試驗(yàn)KA1(S04)2 12H20的終濃度低于0.20%。時，顯微鏡下可 在上層水體中檢出零星細(xì)胞，終濃度為0.20 0.25%。時基本無細(xì)胞檢出， KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.8%。時有變形細(xì)胞，終濃度為1.5%。時發(fā)現(xiàn)有 細(xì)胞破碎，基于成本節(jié)約、絮凝劑水體殘留最低以及細(xì)胞完整度等綜合因素考 慮，選擇0.2 0.25%。為KA1(S04)2 12H20的終濃度。
實(shí)施例4 有毒甲藻Jm/;/wV/i'"/ m cflWeme的采收 本實(shí)施例有毒甲藻Jwp/z^m'wm 的采收，其具體步驟如下
(1) 待培養(yǎng)水體中有毒甲藻4w/ /7^z'm'ww caWerae生長至收獲期，在藻液 中加入絮凝劑KA1(S04)2 12H20至KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.3質(zhì)量 %。，邊加邊攪拌，使藻細(xì)胞大量沉淀；
(2) 靜置1小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細(xì)胞檢出，排去上清水體，收集沉淀液；
(3) 將上述沉淀液以轉(zhuǎn)速3000r/min的離心速度，離心15分鐘，棄去上 清液，底部沉淀即為本實(shí)施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷凍備用。
(4) 對比試驗(yàn)KA1(S04)2 12H20的終濃度低于0.3%。時，顯微鏡下可在 上層水體中檢出零星細(xì)胞，終濃度為0.3 0.35%。時基本無細(xì)胞檢出， KA1(S04)2 12H20的終濃度為1.2%。時有變形細(xì)胞，終濃度為2.5%。時發(fā)現(xiàn)有 細(xì)胞破碎，基于成本節(jié)約、絮凝劑水體殘留最低以及細(xì)胞完整度等綜合因素考 慮，選擇0.3 0.35%。為KA1(S04)2 12H20的終濃度。
實(shí)施例5 有毒甲藻Xm/7/t/力'"/"m A/e6w7的采收 本實(shí)施例有毒甲藻^m/ /z^m'Mm Wefoz7的采收，其具體步驟如下
(1) 待培養(yǎng)水體中有毒甲藻^附; /2^"/"附^^^7生長至收獲期，在藻液中 加入絮凝劑KA1(S04)2 12H20至KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.2質(zhì)量％。， 邊加邊攪拌，使藻細(xì)胞大量沉淀；
(2) 靜置2小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細(xì)胞檢出，排去上清 水體，收集沉淀液；
(3) 將上述沉淀液以轉(zhuǎn)速3000r/min的離心速度，離心10分鐘，棄去上 清液，底部沉淀即為本實(shí)施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷凍備用。
(4) 對比試驗(yàn)KA1(S04)2 12H20的終濃度低于0.2%。時，顯微鏡下可在 上層水體中檢出零星細(xì)胞，終濃度為0.2 0.25%。時基本無細(xì)胞檢出， KA1(S04)2 12H20的終濃度為1.0%。時有變形細(xì)胞，終濃度為2.0%。時發(fā)現(xiàn)有 細(xì)胞破碎，基于成本節(jié)約、絮凝劑水體殘留最低以及細(xì)胞完整度等綜合因素考 慮，選擇0.2 0.25%。為KA1(S04)2 12H20的終濃度。實(shí)施例6收集方法對比試驗(yàn)
本實(shí)施例針對兩種收集方法進(jìn)行比較， 一種是絮凝劑+過濾，另一種是絮
凝劑+離心，其具體步驟如下
(1) 絮凝劑+過濾
a. 在藻液中加入KA1(S04)2 12H20至終濃度為0.2%。，邊加邊攪拌；
b. 用膠管抽去上清水體，收集沉淀于器皿中并逐級濃縮； C.把沉淀的部份倒入分液漏斗中靜置；
d. 放出分液漏斗中的下層沉淀至孔徑為400目的篩絹濾網(wǎng)上，濾去多余 的水分；
e. 用藥勺刮取篩絹上的藻泥至收集瓶中放置冰箱中凍存。
(2) 絮凝劑+離心
a. 在藻液中加入KA1(S04)2 12H20至終濃度為0.2%。，邊加邊攪拌；
b. 靜置2小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細(xì)胞檢出，排去上清 水體，收集沉淀液；
c. 將上述沉淀液以轉(zhuǎn)速2000r / min的離心速度，離心10分鐘，棄去上清 液，收集底部沉淀藻泥置冰箱冷凍備用。
從上述兩個方法的步驟可以看出，"絮凝劑+過濾"方法與"絮凝劑+離心" 方法相比，操作繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力， 一是使用篩絹過濾速度慢，二是篩絹網(wǎng)孔容 易堵塞，難以濾清大量水分，三是篩絹上藻泥不易刮取干凈，四是過濾過程中 篩絹需經(jīng)常清洗，因此不適合用于大規(guī)模生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1、一種有毒甲藻規(guī)模化生產(chǎn)的采收方法，其特征在于該方法采用絮凝劑KA1(SO4)2·12H2O沉淀有毒甲藻細(xì)胞，對沉淀液進(jìn)行離心，收集離心沉淀物即得到有毒甲藻藻體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述絮凝劑KA1(S04)2 12H20 的用量為每1000ml水體中含0.2~0.35g的KA1(S04)2 12H20。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，當(dāng)有毒甲藻為單庫里亞藻時， 絮凝劑KA1(S04)2 12H20的用量為每lOOOml水體中含0.3~0.35g的 KA1(S04)2 12H20。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，當(dāng)有毒甲藻為利瑪原甲藻時， 其絮凝劑KA1(S04)2 12H20的用量為每lOOOml水體中含0.2 0.25g的 KA1(S04)2 12H20。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，當(dāng)有毒甲藻為慢原甲藻時， 其絮凝劑KA1(S04)2 12H20的用量為每lOOOml水體中含0.2~0.25g的 KA1(S04)2 12H20。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，當(dāng)有毒甲藻為卡氏前溝藻時， 其絮凝劑KA1(S04)2 12H20的用量為每lOOOml水體中含0.25 0.3g的 KA1(S04)2 12H2。。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，當(dāng)有毒甲藻為克氏前溝藻時， 其絮凝劑KA1(S04)2 12H20的用量為每lOOOml水體中含0.2~0.25g的 KA1(S04)2 12H20。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于該方法包括如下歩驟(1)向有毒甲藻藻液中加入絮凝劑KA1(S04)2 12H20;(2) 靜置1 2小時后，除去上清水體，收集沉淀液；(3) 將上述沉淀液離心后，棄去上清液，收集底部沉淀物。
9、根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述步驟(3)中離心的轉(zhuǎn)速 為200(K3000r / min，時間為10 15分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開一種有毒甲藻規(guī)模化生產(chǎn)的采收方法，該方法采用絮凝劑KAl(SO₄)₂·12H₂O沉淀有毒甲藻細(xì)胞，通過離心收集得到有毒甲藻藻體。本發(fā)明對不同種類有毒甲藻提供恰當(dāng)合適的絮凝劑用量，并結(jié)合離心方法，可避免絮凝劑用量過大，細(xì)胞破裂內(nèi)容物毒素外泄，也可避免絮凝劑用量過少細(xì)胞沉淀不下來，還可以避免單獨(dú)使用離心法收集的高投資高能耗問題。本發(fā)明采用絮凝劑沉淀甲藻細(xì)胞后，選擇離心的方法來進(jìn)一步純化得到藻泥，離心能提高大規(guī)模生產(chǎn)時候的純化速度，而且能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)時對大量沉淀液的純化。本發(fā)明方法可實(shí)現(xiàn)安全、高效、大量且細(xì)胞完整無破損地采收有毒甲藻，從而達(dá)到提取活性次生代謝產(chǎn)物甲藻毒素的目的。
文檔編號C12N1/12GK101586079SQ200910040408
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者何偉宏, 軍 吳, 偲 張, 李慶欣, 梁計林, 龍麗娟 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所