專利名稱：一種貝類凝集素基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種貝類凝集素基因及其應用。
背景技術：
馬氏珠母貝(Pinctada martensii)又稱合浦珠母貝，是中國及世界上海水珍珠培育的最主要貝類之一，廣泛分布于熱帶、亞熱帶的太平洋和印度洋沿岸。其中在中國主要分布在廣東、廣西、海南和臺灣沿海。在中國，自從1965年馬氏珠母貝人工育苗成功地推廣以來，海水珍珠養殖的面積不斷擴大，產量逐年增加，海水珍珠已成為我國重要的出口產品。以其培育的珍珠被稱為“南珠”，聞名于國內外。但是由于長期的人工養殖和繁育，育珠貝變小，死亡率增加，馬氏珠母貝種質已呈現明顯退化現象、珍珠的產量和質量都明顯下降。研究其先天性免疫機制將有助于其疾病防治和增加珍珠產量。貝類屬于無脊椎動物軟體動物門，其種類多達115000，是動物界的第二大門， 也是世界上最重要經濟類群之一。在貝類中，免疫包括體液免疫和細胞介導的免疫。這二者協同作用，共同抵御微生物對機體的入侵。血細胞通過受體介導的包吞作用和各種細胞毒性反應(例如釋放溶酶體酶、抗菌肽、經由呼吸爆發而產生的活性氧)殺傷入侵微生物。參與貝類細胞免疫的受體主要包括兩大類一類是細胞表面受體，例如血細胞膜上的凝集素； 另一類是具有調理作用的調理素，例如血清凝集素。目前在馬氏珠母貝中分離的凝集素還極為有限，因此有必要分離更多的相關因子，以更深入的了解其抗病機理。

發明內容
本發明的目的在于根據現有技術中存在的上述不足，提供一種貝類凝集素基因。本發明另一目的在于提供上述貝類凝集素基因在體外的重組表達方法。本發明還有一個目的在于提供上述貝類凝集素基因在介導細胞凝集中的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現
本發明所述的HMG基因(貝類凝集素基因)是從馬氏珠母貝抑制性差減雜交文庫中篩選出來的。在隨機挑選并測序的2000個克隆中，共檢測到該基因的一個克隆。該基因cDNA 全長819bp，其cDNA序列如SEQ ID NO: 1所示；自41bp至52!3bp區段為其開放閱讀框，編碼173個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；5，非編碼區長40bp，3，非編碼區長 296bp,有多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴。一種表達載體，含有上述的貝類凝集素基因。本發明所述貝類凝集素基因編碼的蛋白的表達過程中，使用的表達載體為 pMAL-c2X，使用的細胞系為BL21 (DE3)。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明使用實時定量PCR技術分析了馬氏珠母貝/M mRNA在血細胞、消化腺、腮、外套膜、心臟、閉殼肌、性腺組織中的表達水平。結果表明—在血細胞、消化腺、腮中有高水平的表達，在性腺和外套膜中有中度表達，在心臟和閉殼肌中幾乎無表達。當病原體入侵機體
3后，機體會產生免疫應答反應，與免疫相關的基因的表達會產生明顯的變化。運用實時定量 PCR技術檢測了馬氏珠母貝在受弧菌刺激后，其血細胞中的的表達水平的變化。結果表明，在受弧菌刺激后48小時，血細胞中的· mRNA達到最高水平(P<0. 05)，之后表達水平逐漸下降，在刺激后7 恢復到正常水平。使用原核表達方法制備該基因的重組蛋白，用于研究該基因在介導血細胞凝集和細菌凝集方面的作用。


圖1為實時定量PCR檢測· mRNA在不同組織中的分布；血細胞haemocytes ； ffl it 1/1 :hepatopancreas ； :heart ； Ig :gill ；夕卜· H :mantle ； f生 gonad ； 1 Ul adductor muscle。結果表明·在血細胞、消化腺、腮中有高水平的表達，在性腺和外套膜中有中度表達，在心臟和閉殼肌中幾乎無表達；
圖2為弧菌刺激后，血細胞中·的表達模式；星號(*)指示與Oh對照組之間有顯著性差異；
圖3為純化的HMG重組蛋白；Lanel 蛋白標記；Lane 2 重組表達的MBP-HMG ；Lane3: 純化的MBP標簽；箭頭指示重組表達的目的蛋白MBP-HMG。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。
實施例1. RNA 提取
總RNA的提取使用SV Total RNA Isolation System (Promega)提取，具體步驟如下 A、取少量組織(不超過30 mg)于液氮預冷的研缽中，將組織磨成粉末之后，轉移到裝有 175 μ L RNA Lysis Buffer的離心管中并混勻。B、向裂解產物中加入350 μ L RNA Dilution Buffer (RDA)0顛倒3-4次混合溶液。在70°C干浴鍋上處理3 min。C、在13，OOOXg離心10 min。轉移上清到一個新的離心管。向上清中加入200 μ L乙醇，通過顛倒3-4次混勻。將混合物轉移到離心柱，在13，OOOXg離心1 min。D、丟棄收集管中的液體。將離心柱重新放回到收集管。加入600 μ L RLA，在 13，000 Xg 離心 1 min。Ε、倒掉收集管中的液體。F、制備DNase 反應混合物40 μ L Yellow Core Buffer, 5 μ L 0. 09 M MnCl2 和 5 μ L DNase I溶液(冰上解凍)。通過輕輕的吹打混勻溶液。向每一個離心柱加入50 μ L 新鮮制備的DNase I孵育混合物。G、在室溫孵育 15 min 之后，加入 250 μ L DNase Stop Solution (DSA)，在 13，OOOXg 離心 1 min。H、加入 600 μ L RNA Wash Solution (RWA)，在 13，000Xg 離心 1 min。
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I、倒空收集管，加入 250 μ L RNA Wash Solution (RWA)，高速離心 2 min。J、丟掉收集管，將離心柱裝入1.5 ml的離心管，加100 PL無核酸酶水，然后，在13，OOOXg離心1 min，棄離心柱，使用分光光度計測量RNA的濃度，分裝后，貯存于_80°C。2.差減雜交文庫構建
差減雜交文庫使用 PCRIelect cDNA Subtraction Kit (Clontech, USA)試劑盒進行構建。馬氏珠母貝受弧菌刺激他后，收集血細胞，按照上述的方法提取血細胞總RNA，并使用同樣的方法提取對照組(未受弧菌處理)血細胞總RNA。以刺激后馬氏珠母貝作為tester， 對照組作為driver，進行扣除雜交。將差減雜交后的cDNAs亞克隆到pGEM-T-easy載體 (Promega, USA)并轉化到 Esctwrichis coli JM109 (Promega, USA)感受態細胞。隨機挑選2000個克隆并進行測序。3.反轉錄
cDNA 的制備使用 STOR PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa)試劑盒。反應總體積為20mL。在200mL薄壁管中依次加入以下成份5 XI^rimeScript buffer 4mL, PrimeScript RT Enzyme mix :lmL,隨機六堿基核苷酸2mL，總 RNA :300ng，RNA 酶抑制劑(TaKaRa) :20U。將上述成份混勻，在37°C處理30分鐘，85°C處理10秒，一 20°C保存。4.實時定量PCR
進行實時定量PCR (qRT-PCR)所使用的試劑盒為STOR PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa)，所使用的儀器為 LightCycler 480 System (Roche), 所使用的模板為上述所獲得的反轉錄產物，所使用的內參為A-adi ，所使用的引物有 qRT-HMG For (SEQ ID NO:3), qRT-HMG Rev (SEQ ID NO:4) ；qRT-β -actin For (SEQ ID NO: 5), qRT-β -actin Rev (SEQ ID N0:6)。qRT-PCR 的反應體系如下2XMix :10mL, qRT-HMG For :0. 2mM ；qRT- HMG Rev :0. 2mM ；反轉錄產物(cDNA) :50ng。熱循環條件如下95°C 處理10 min ；接下來運行40個循環95°C變性5秒，60°C退火延伸20秒。qRT-PCR運行完成后，進行溶解曲線分析以確定PCR擴增是否特異。使用2 —DDCT方法對轉錄本進行相對定量。對于每一份樣品，實驗組和對照組均設置3個平行反應。5.重組蛋白的原核表達和純化
以編碼HMG蛋白的核苷酸序列和pMAl_c2X載體制備表達質粒，然后轉化BL21 (DE3)。 挑選單克隆并培養至OD=O. 6，然后加入IPTG至終濃度為0. ImM,在22°C，220rmp的條件下誘導表達。4h后收集菌液，4°C，12，000Xg離心10分鐘。加入Column Buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4，200 mM NaCl, 1 mM EDTA)，超聲破碎，離心，取上清，使用 Amylose resin column (NEW ENGLAND BioLabs)進行親和純化。使用SDS-PAGE膠檢測純化產物的大小和純度。
權利要求
1.一種貝類凝集素基因，其特征在于其CDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.根據權利要求1所述的貝類凝集素基因，其特征在于基因的cDNA全長819bp，自 41bp至52!3bp區段為開放閱讀框，編碼173個氨基酸，5’非編碼區長40bp，3’非編碼區長 296bp,有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴。
3.權利要求1所述的貝類凝集素基因編碼的蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQID N0:2所示。
4.一種表達載體，其特征在于含有權利要求1所述的貝類凝集素基因。
5.權利要求3所述貝類凝集素基因編碼的蛋白的表達方法，其特征在于使用的表達載體為 pMAL-c2X，使用的 fecAericAia coli 細胞系為 BL21 (DE3)。
6.權利要求3所述貝類凝集素基因編碼的蛋白在介導細菌凝集中的應用。
7.權利要求3所述貝類凝集素基因編碼的蛋白在介導紅細胞凝集中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種貝類凝集素基因及其應用。本發明所述貝類凝集素基因的cDNA全長819bp，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，自41bp至523bp區段為開放閱讀框，編碼173個氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；5’非編碼區長40bp，3’非編碼區長296bp，有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴。本發明所述貝類凝集素基因在貝類免疫反應過程中發揮了重要的作用。
文檔編號C12N15/12GK102250909SQ20111014862
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月3日 優先權日2011年6月3日
發明者喻子牛, 張揚, 陳金輝 申請人:中國科學院南海海洋研究所