專利名稱：轉基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁側序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及轉基因植物檢測領域，具體地說，涉及轉基因水稻品系Bar68_l的外源插入片段的旁側序列，以及根據該旁側序列設計特異性引物PCR檢測轉基因水稻品系Bar68~l。
背景技術：
水稻是我國重要的糧食作物之一，隨著轉基因技術在水稻中的研究和應用，已經有多個轉基因水稻品系進入了環境釋放，并申請商業化種植。2009年8月，我國農業部發放了轉基因水稻品系華恢I號和Bt汕優63的生產應用安全證書。對轉基因植物進行品系特異性的檢測是對轉基因植物進行監督管理，保障其健康發展的重要技術基礎。而外源基因 的旁側序列是評估轉基因植物安全性的最重要的分子特征之一，因此，轉基因植物外源插入片段的旁側序列是評估轉基因生物安全性的重要資料。目前，已知一些轉基因水稻外源插入載體旁側序列的相關報道，例如，謝家建等人利用TAIL-PCR、Genome walking和LD-PCR等方法獲得了轉基因水稻克螟稻、Bt汕優63、科豐6號和科豐8號的外源插入片段的旁側序列，并建立了品系特異性的檢測方法。但是，目前為止，尚未發現任何關于轉基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁側序列的相關報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種轉基因水稻品系Bar68_l的外源插入片段的旁側序列及其應用。本發明的另一目的是提供一種轉基因水稻Bar68_l的品系特異性PCR檢測方法。本發明的進一步目的是提供用于檢測轉基因水稻品系Bar68_l的特異性引物及含有該引物的檢測試劑盒。為了實現本發明目的，本發明的轉基因水稻品系Bar68_l的外源插入片段的旁側序列，所述旁側序列為3’端旁側序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，或與SEQ ID NO. I所示的序列同源性在99%以上的核苷酸序列。所述3’端旁側序列的制備方法以轉基因水稻品系Bar68_l的基因組DNA為模板，通過hi TAIL-PCR擴增得到。本發明的轉基因水稻品系Bar68_l的外源插入片段的旁側序列，所述旁側序列為5’端旁側序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示,或與SEQ ID NO. 2所示的序列同源性在99%以上的核苷酸序列。所述5’端旁側序列的制備方法以轉基因水稻品系Bar68_l的基因組DNA為模板，通過hi TAIL-PCR和PCR擴增得到。根據SEQ ID NO. I中第1-318位核苷酸序列設計正向引物，根據SEQ ID NO. I的第319-1099位核苷酸序列設計反向引物，建立轉基因水稻Bar68-1品系特異性的定性PCR檢測方法所述正向引物為Bar-F :5' -CCATATTCAGCTCGCCTTGC-3'；所述反向引物為Bar-R :5' TGGTTTTTGTTGTCCGTGCCT-3'。前述的方法包括以下步驟1)提取植物基因組；2)以步驟I)的基因組為模板，利用上述特異性引物Bar-F和Bar-R進行PCR檢測。
優選的PCR 反應條件為94°C 5min ；94 °C 30s, 58 °C 30s, 72 °C 30s, 35 個循環；72 °C 7min。優選的PCR反應體系如表I所示表IPCR反應體系
權利要求
1.轉基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁側序列，所述旁側序列為3’端旁側序列，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，或與SEQ ID NO. I所示的序列同源性在99%以上的核苷酸序列。
2.轉基因水稻品系Bar68-1的外源 插入片段的旁側序列，所述旁側序列為5’端旁側序列，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，或與SEQ ID NO. 2所示的序列同源性在99%以上的核苷酸序列。
3.制備權利要求I所述的旁側序列的方法，其是以轉基因水稻品系Bar68-1的基因組DNA為模板，通過hi TAIL-PCR擴增得到。
4.制備權利要求2所述的旁側序列的方法，其是以轉基因水稻品系Bar68-1的基因組DNA為模板，通過hi TAIL-PCR和PCR擴增得到。
5.采用權利要求I或權利要求2所述的旁側序列設計特異性引物PCR檢測轉基因水稻品系Bar68-1的方法，其特征在于，所述特異性引物為 正向引物 Bar-F 5' -CCATATTCAGCTCGCCTTGC-3'和 反向引物 Bar-R 5' -TGGTTTTTGTTGTCCGTGCCT-3'。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取植物基因組； 2)以步驟I)的基因組為模板，利用權利要求5的特異性引物進行PCR檢測。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為94°C5min ；94°C 30s，58°C 30s, 72°C 30s，35 個循環；72°C 7min。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應體系為反應試刻體積(μ )終濃度DNA 模板IlOOng/μΙIOxPCR 緩沖液5Ix ( 1.5mMMgCl2)2dNTPs20.2mM 引物 Bar-F0.50.2μΜ引物 Bar-R0.50.2μΜDNA 聚合酶0.1251.25u ddH20補足至25μ1
9.一種檢測轉基因水稻品系Bar68-1的試劑盒，其特征在于，其包含以下引物 正向引物 Bar-F 5' -CCATATTCAGCTCGCCTTGC-3'和 反向引物 Bar-R 5' -TGGTTTTTGTTGTCCGTGCCT-3'。
10.權利要求9所述的試劑盒在檢測轉基因水稻品系Bar68-1中的應用。
全文摘要
本發明涉及轉基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁側序列及其應用，所述旁側序列包括3’端旁側序列和5’端旁側序列，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。利用該旁側序列作為目的DNA擴增片段建立靈敏、特異性的轉基因水稻品系Bar68-1的品系特異性定性PCR檢測方法，可廣泛用于生物技術領域中轉基因水稻的安全評估和檢測。
文檔編號C12N15/11GK102888398SQ201110206849
公開日2013年1月23日 申請日期2011年7月22日 優先權日2011年7月22日
發明者金蕪軍, 宛煜嵩, 王文娟, 張秀杰, 苗朝華 申請人:中國農業科學院生物技術研究所