利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法：在表達外源基因的同時，利用內源性miRNA作為前體，定向抑制水稻中除草劑解毒酶表達，從而獲得安全、可選擇滅殺的轉基因水稻。具體為：將外源基因表達框與定向抑制解毒酶的amiRNAs表達框構建在同一個植物表達載體上；所述amiRNA表達框包括由啟動子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和終止子功能性連接而成。本發明通過定向沉默水稻中參與除草劑解毒和脫毒代謝酶基因的表達，從而獲得了一種能安全選擇消滅轉基因水稻的方法。
【專利說明】利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法，以及所用的基因、質粒屬于基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]轉基因農作物目前已經在世界上許多國家大量推廣，我國也在大力發展、推廣轉基因技術和轉基因研究。當下，利用轉基因農作物作為生物反應器來生產藥用蛋白、工業酶等研究工作也開展得如火如荼(Larrick and Thomas, Current Opinion in Biotechnology, 2001, 12:411-418)。種植這些轉基因農作物存在其可能混入非轉基因農作物從而導致混入人食物中的重要健康安全隱患以及轉基因漂移等生態安全隱患，因此，發明一種簡便、控制轉基因農作傳播方法具有重大的現實意義。
[0003]細胞色素P450是一類利用NADPH所傳遞的電子去催化分子氧活化的血紅素蛋白，占植物基因的1%，是植物中一類重要的酶。它在植物體內介導一系列氧化反應，其功能涉及木質素、留醇、內萜、生物堿、脂肪酸和許多起植保素功效的次生物質合成代謝，以及天然和人工合成的許多外源抗生素(如除草劑)等物質的降解和除毒代謝等，在植物生長發育、防御病蟲害和適應逆境中有著特別重要的作用。細胞色素P450是一個超基因家族， 植物中命名的已超過1000個，水稻中可能的有500多個，截止目前，生物學功能被確切驗證的植物P450基因只有40個左右，目前的研究顯示P450在水稻自身防御中具有重要作用，是茉莉酸途徑中的一類重要氧化酶，參與合成二萜、羥色胺等多種用于防御的此生代謝產物(Fujiwara T et al, Joural of Biology Chemistry, 2010285:11308-11313; Reub en J P et al, Phytochemisty2006, 67:2307-2317)。CYP81A6 基因是水稻 P450 基因家族中苯達松、磺酰脲類除草劑解毒酶基因，故水稻對苯達松、磺酰脲類除草劑有良好的抗性 (Siminiszky, Phytochemistry Reviews5:445-458;Pan et al, Plant Molecular Biology, 2006, 61:933-943;Werck-Reichhart et al, Trends in Plant Science5:116-123)。將水稻解毒的P450基因用反義RNA或RNAi技術與目的基因以及其它相關構建于同一載體，就可以在表達目的基因的同時獲得可以選擇滅殺的轉基因植物(生物反應器)。
[0004]目前應用的反義RNA或RNAi沉默技術盡管能夠達到選擇滅殺轉基因水稻的目的， 但是它存在很多的問題，其中最重要有“脫靶效應”:水稻中P450基因是一個超基因家族， 其彼此間的同源性很高，在構建RNA或RNAi沉默載體產生轉基因水稻時，dicer酶酶切前體siRNA (dsRNA)不是單一位點酶切，會產生大量siRNA，可能會造成目的基因脫靶；同時， 水稻被注釋的基因只有60%左右，由于RNA聚合酶`的作用，可能會產生次生的siRNA，產生 “非靶標效應”，在沉默靶基因的同時，也導致非靶標基因也被沉默，從而可能導致一些有益農藝性狀的消失以及一些不可預知的水稻功能缺失(Stephan Ossowski et al, The Plant Joural2008, 53:674-690 ；Norman Warthmann et al, PLoS ONE, 2008, 3 (3);張曉輝等，自然科學進展，2009，10:1029-1036)。所以急需一個特異性高、安全、無明顯副作用的沉默技術以及方法。[0005]miRNAs (microRNAs)是一種高度保守的、長度為18-25個核苷酸的單鏈RNA小分子，廣泛存在于真核生物中，最早在1993年于秀桿線蟲中被發現。miRNAs前體與沉默目標基因存在I個至幾個堿基的不完全配對或完全配對，在dicer酶的作用下，miRNAs前體偏好產生并聚集一種sRNA雙鏈結構(miRNA-miRNA*)，然后與整合到沉默復合體(RISC)中，最后與靶基因的mRNA3’未翻譯區結合，完全匹配的導致mRNA降解而達到靶基因沉默，不完全配對的導致mRNA轉錄抑制而達到祀基因沉默(Norman Warthmann et al, PLoSONE, 2008, 3(3);Stephan Ossowski et al, The Plant Joural2008, 53:674-690)。miRNA沉默技術特異性高、效率高、遺傳穩定、作用時間長、體內穩定、高RNA啟動子兼容性、無明顯毒性等優點(Shao Yao Ying, MicroRNA Protocols, 2006, Humana press Inc;KrisshnaraoAppasani, MicroRNAs:From Basic Science to Disease Biology,2008, CambridgeUniversity Press)，其在功能基因組學研究、基因治療、動植物抵抗外源病毒等領域具有廣泛的應用前景。amiRNAs (artificial micoRNAs)是利用內源性miRNA前體產生sRNA來實現基因沉默。2002年amiRNAs沉默技術第一次在人細胞系中應用，之后在多種植物和動物中應用。
[0006]目前還沒有一個既能表達外源蛋白同時又能安全、可選擇滅殺的轉基因水稻(生物反應器)的方法。

【發明內容】

[0007]本發明要解決的技術問題是提供一種利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻方法；本發明通過定向沉默水稻中參與除草劑解毒和脫毒代謝酶基因的表達，從而獲得了一種能安全選擇消滅轉基因水稻的方法。 [0008]為了解決上述技術問題，本發明提供一種利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法，在表達外源基因的同時，利用內源性miRNA作為前體，定向抑制水稻中除草劑解毒酶表達，從而獲得安全、可選擇滅殺的轉基因水稻。
[0009]作為本發明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法的改進:將外源基因表達框與定向抑制解毒酶的amiRNAs表達框(amiRNA表達抑制框)構建在同一個植物表達載體上；
[0010]amiRNA表達框包括由啟動子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和終止子功能性連接而成。
[0011]作為本發明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法的進一步改進:表達的外源基因為醫用蛋白基因、工業酶基因、抗蟲基因或抗除草劑基因。
[0012]作為本發明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法的進一步改進:作為前體的內源性miRNA命名為0S-528，其多核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
[0013]作為本發明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法的進一步改進:除草劑解毒酶基因為CYP81A6，其多核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
[0014]作為本發明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法的進一步改進:在水稻中表達外源基因(目的基因)的同時定向抑制苯達松或磺酰脲類除草劑解毒基因CYP81A6的表達，所得的轉基因水稻就能被苯達松或磺酰脲類除草劑選擇滅殺；
[0015]即，將目的基因(外源基因)表達框和苯達松、磺酰脲類除草劑解毒酶基因CYP81A6表達抑制框連接在同一個載體上，轉化時它們在同一個T-DNA片段上導入植物染色體中。
[0016]作為本發明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法的進ー步改進:
[0017]amiRNAs核苷酸序列為以下:
[0018]miRl-F:AGTCAATACATGAGTTCGTCCGGCAGGAGATTCAGTTTGA ；
[0019]miRl-R:TGCCGGACGAACTCATGTATTGACTGCTGCTGCTACAGCC ；
[0020]miRl1-F:CTCCGGAgGAAgTCATGTATTGATTCCTGCTGCTAGGCTG ；
[0021]miRll-R:AATCAATACATGAcTTCcTCCGGAGAGAGGCAAAAGTGAA0
[0022]備注說明:
[0023]amiRNAs存在1_2個堿基錯配，小寫字體代表的是錯配堿基；帶下劃線的字體代表的是設計的人工miRNAs。
[0024]作為本發明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法的進ー步改進:所得的載體為1300-35S-Ubq-1174-Ubq_CYP81A6i，將所述1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i載體導入水稻中，最終獲得抗草甘膦而對除草劑苯達松敏感的轉基因水稻。
[0025]備注說明:1174相當于ー個外源基因。
[0026]本發明是一種利用`人工小分子RNAs (artificial microRNAs, amiRNAs)獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法。
[0027]具體而言，本發明采用的技術方案是:
[0028]在表達目的基因(外源基因)的同時，利用amiRNAs方法，抑制轉基因水稻中參與除草劑解毒、脫毒基因的表達，獲得可被安全選擇滅殺的轉基因水稻。
[0029]具體地，所述目標除草劑為苯達松或磺酰脲類除草剤，它們是農業上常用的除草劑，對多種闊葉雜草具有良好的除草能力，水稻具有對這兩種除草劑的解毒酶CYP81A6，故對這兩種除草劑有良好的抗性(Siminiszky, Phytochemistry Reviews5:445-458;Panet al,Plant Molecular Biology, 2006, 61:933-943;Werck-Reichhart et al, Trendsin Plant Science5:116-123)。故在水稻中表達目的基因的同時定向抑制苯達松或磺酰脲類除草劑解毒基因CYP81A6的表達，轉基因水稻就可以被苯達松或磺酰脲類除草劑選擇滅殺。2002年amiRNAs沉默技術第一次在人細胞系中成功應用，隨后在多種植物和動物中應用，盡管其功能機制還有待于進一歩的研究，但由于amiRNAs沉默技術特異性高、效率高、遺傳穩定、作用時間長、體內穩定、高RNA啟動子兼容性、無明顯毒性等優點(Shao Yao Ying, MicroRNA Protocols,2006, Humana press Inc;KrisshnaraoAppasani, MicroRNAs:From Basic Science to Disease Biology,2008,CambridgeUniversity Press),其已成為新一代沉默技術的代表(Norman Warthmann et al, PLoSONE,2008, 3(3);Stephan Ossowski et al, The Plant Joural2008, 53:674-690)。amiRNA表達抑制框可以由一個啟動子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段、終止子等功能性連接而成。啟動子可選擇玉米泛素啟動子Zmub1-1 (Christensen and Quail, TransgenicRes, 5:213-8),或水稻泛素啟動子(Wang and Oard, Plant Cell Reports, 22:129-134),或水稻 Actin 啟動子(McElroy et al, Plant Cell2:163-171 )，或 CaMV35S 啟動子，或其它在水稻中有活性的啟動子，終止子可為廣泛利用的CaMV35S終止子、Nos終止子等。[0030]在本發明中，為使得到的轉基因水稻能穩定傳代，目的基因表達框與定向抑制的苯達松、磺酰脲類除草劑解毒酶基因CYP81A6的表達框緊密連鎖。這種連鎖在本發明中是通過插入DNA片段的構建來實現:即將目的基因表達框和苯達松、磺酰脲類除草劑解毒酶基因CYP81A6表達抑制框連接在同一個載體上，轉化時它們在同一個T-DNA片段上導入植物染色體中。例如利用農桿菌轉化時，則是連接在同一個T-DNA片段中；利用基因槍方法時，則連接在同一個載體上的同一個DNA插入片段中。
[0031]具體地:
[0032]1.內源miRNA至少具有以下核苷酸序列編碼:SEQ ID NO:1。
[0033]2.被抑制表達苯達松、磺酰脲類除草劑解毒酶基因CYP81A6至少具有以下核苷酸序列編碼:SEQ ID NO:2。
[0034]3.amiRNAs至少具有以下核苷酸序列:
[0035]
【權利要求】
1.利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法，其特征在于:在表達外源基因的同時，利用內源性miRNA作為前體，定向抑制水稻中除草劑解毒酶表達，從而獲得安全、可選擇滅殺的轉基因水稻。
2.根據權利要求1所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法，其特征在于:將外源基因表達框與定向抑制解毒酶的amiRNAs表達框構建在同一個植物表達載體上； 所述amiRNA表達框包括由啟動子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和終止子功能性連接而成。
3.根據權利要求2所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法，其特征在于:表達的外源基因為醫用蛋白基因、エ業酶基因、抗蟲基因或抗除草劑基因。
4.根據權利要求3所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法，其特征在于:作為前體的內源性miRNA命名為0S-528，其多核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
5.根據權利要求4所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法，其特征在于:除草劑解毒酶基因為CYP81A6，其多核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
6.根據權利要求5所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法，其特征在干:在水稻中表達外源基因的同時定向抑制苯達松或磺酰脲類除草劑解毒基因CYP81A6的表達，所得的轉基因水稻就能被苯達松或磺酰脲類除草劑選擇滅殺。
7.根據權利要求6所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法，其特征在于:
8.根據權利要求7所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉基因水稻的方法，其特征在于:所得的載體為1300-35S-Ubq-1174-Ubq_CYP81A6i，將所述.1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i載體導入水稻中，最終獲得抗草甘膦而對除草劑苯達松敏感的轉基因水稻。
【文檔編號】C12N15/84GK103602705SQ201310558050
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月11日 優先權日:2013年11月11日
【發明者】劉明宏, 沈志成 申請人:浙江大學