轉基因水稻品系134Bt的外源插入片段旁側序列、其擴增引物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種轉基因水稻品系134Bt的外源插入片段的3’端和5’端旁側序列及其應用以及所述旁側序列的擴增引物。利用該旁側序列作為目的DNA擴增片段，可以建立靈敏、特異性的轉基因水稻品系134Bt的品系特異性定性PCR檢測方法，可廣泛用于生物【技術領域】中的轉基因水稻的安全評估和檢測。CGMCC No934920140714
【專利說明】轉基因水稻品系134Bt的外源插入片段旁側序列、其擴增 引物及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物生物【技術領域】，具體地，涉及一種轉基因水稻品系134Bt外源插 入片段旁側序列以及用于檢測該序列的PCR引物。此外，本發明還涉及所述旁側序列和引 物進行轉基因水稻品系檢測或鑒定的方法和試劑盒。

【背景技術】
[0002] 水稻是我國重要的糧食作物之一，隨著轉基因技術在水稻中的廣泛研究和應用， 已經有多個轉基因水稻品系獲準環境釋放。對此，需要對轉基因植物進行監督管理，保障其 健康發展。例如對轉基因植物進行轉化事件特異性的檢測。
[0003] 轉基因植物的外源插入片段的旁側序列是轉基因植物品系最重要的分子特征之 一，因此，外源插入片段的旁側序列是建立轉基因植物轉化事件特異性檢測方法的重要技 術資料。目前已經有部分專利和文獻報道了關于轉基因植物外源插入載體旁側序列，如張 大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系M0N863的外源插入片段的旁側序 列，建立了轉基因 M0N863玉米品系的特異性檢測方法；楊永義等分析了轉基因水稻品系 223f-S21的外源插入片段的旁側序列，并進一步建立了轉基因系特異性PCR的檢測方法， 張秀杰等公開了轉基因水稻PA110-5品系特異性PCR定性檢測引物及定性檢測方法和試劑 盒。
[0004] 水稻品系134Bt是利用農桿菌介導的遺傳轉化方法，將人工改造后的cryIAcl基 因（GENBANK登記號：AY126450)導入江浙滬地區目前廣泛種植的高產優質粳稻品種"秀水 134"中，通過分子手段篩選出具有crylAcl轉錄活性的單拷貝的、整合了完整目的基因且 T-DNA插入位點未打斷已知功能基因的獨立轉化體，并通過后代自交分離篩選獲得純系。但 是，到目前為止，尚未建立關于轉抗蟲基因134Bt品系的特異性PCR檢測方法。


【發明內容】

[0005] 針對上述技術問題，本發明的一個目的為提供一種轉基因水稻品系134Bt的外源 插入片段的旁側序列，并針對該旁側序列提供對其進行特異性檢測的DNA序列，例如PCR擴 增引物序列。本發明的另一個目的為提供所述旁側序列和引物的應用，包括提供旁側序列 或引物在檢測水稻中是否含有轉基因水稻品系134Bt來源的成分中的用途，或者制備檢測 水稻中是否含有轉基因水稻品系134Bt來源的成分的試劑盒中的用途。此外，本發明的又 一個目的為提供一種轉基因水稻品系134Bt的檢測方法。
[0006] 本發明的轉基因水稻品系134Bt按如下方式獲得：
[0007] 取授粉后12-15天的未成熟的秀水134水稻種子經70%乙醇表明消毒1分鐘，于 NaClO溶液中（體積比1:4,加2-3滴吐溫20)消毒90分鐘,用無菌水沖洗4-5次,然后用 解剖刀和鑷子挑出幼胚并接種于N6培養基上誘導愈傷組織，置于28°C，暗室培養，5天后獲 得的初生愈傷組織用于轉化。
[0008] 菌液的準備具體為：含pZTRT-Bt質粒（T-DNA結構域見圖1，其構建參見Eun Hye Kim等人，Chloroplast-targeted expression of synthetic cryIAc in transgenic rice as an alternative strategy for increased pest protection, Planta(2009)230:39 7 - 405)的農桿菌離心收集后用含200 μ M的乙酰丁香酮（AS)AA液體培養基懸浮（簡稱 AA-AS);超凈工作臺上將幼胚誘導的初生愈傷組織置于農桿菌AA-AS懸浮液中20min，期間 不斷搖動；倒掉菌液，將愈傷組織置于無菌濾紙上風干5?IOmin ;然后，轉移至表面以無菌 濾紙覆蓋的CC-AS (200 μ M)共培養培養基中，28°C黑暗條件下培養50?55小時；共培養后 的愈傷組織轉移到含2. 0mg/L的2, 4-D和500mg/L頭孢霉素的N6抑菌培養基中，使愈傷組 織恢復3?4天；愈傷組織轉移到含2. 0mg/L的2, 4-D、500mg/L頭孢霉素和5mg/L Basta 的N6篩選培養基上繼代培養3-4次就可以獲得抗性愈傷組織；抗性愈傷組織轉移到再生培 養基獲得轉基因植株；再生植株轉移到Yoshida營養液中水培過渡，后移栽入大田或溫室 土培直到成熟，共獲得12個獨立轉化體。
[0009] 利用熒光定量PCR方法對12個獨立轉化體分析插入基因拷貝數，具體方法為： 水稻基因組DNA提取采用CTAB法，用BioPhotometer分光光度計（Eppendorf公司）檢 測DNA含量及純度。水稻內標準基因鹿糖磷酸合成酶基因 （Sucrose phosphate synthase gene，SPS GeneBank No. U33175)引物序列參照 Ding 等報道（Ding J Y, Jia J W, Yang L T, et al. Validation of a rice specific gene, sucrose phosphate synthase, used as the endogenous reference gene for qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenes· J Agric Food Chem，2004, 52(11) :3372-3377.),利用 Primer Premier 5軟件設計了 CrylAcl引物序列（見表I)。引物由上海生物工程有限公司合成， 其核苷酸序列和擴增片段長度見表1。
[0010]定量 PCR 體系為：SYBR? Premix Ex Taq?(2X) 12. 5 μ I, PCR 上游引物 (10μπιο1/υ〇· 5μ 1，PCR下游引物（10μπιο1/υ〇· 5μ 1，DNA模板2μ 1，滅菌蒸餾水9· 5μ 1， 總體積25 μ 1。定量PCR的反應程序為（兩步法PCR反應程序）：預變性95°C 30s，循環數 I :PCR反應第一步95°C 5s ;第二步，60°C退火延伸40s，共進行45個循環。熒光定量PCR儀 為ABI PRISM 7000Real-Time PCR system。每個試樣做3個生物學重復,每個生物學重復 做3次技術重復。12個獨立轉化體中獲得3個單拷貝轉化體。
[0011] 表1定量PCR引物和探針序列

【權利要求】
1. 轉基因水稻品系134Bt的外源插入片段的旁側序列，其特征在于，所述旁側序列為 如SEQ ID No: 1所示的3'端旁側序列。
2. 轉基因水稻品系134Bt的外源插入片段的旁側序列，其特征在于，所述旁側序列為 如SEQ ID No:2所示的5'端旁側序列。
3. 如權利要求1和/或2所述的旁側序列在檢測水稻或其制品中是否含有轉基因水稻 品系134Bt來源的成分中的用途。
4. 如權利要求1和/或2所述的旁側序列在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于檢 測水稻或其制品中是否含有轉基因水稻品系134Bt來源的成分。
5. 轉基因水稻品系134Bt的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括，通過檢測待檢 測水稻的基因組DNA中是否存在如權利要求1和/或2所述的旁側序列或其片段，來檢測 所述水稻是否含有轉基因水稻品系134Bt來源的成分。
6. 根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括，依據SEQ ID No: 1所示序列設計PCR擴增的正向引物和反向引物，以待檢測水稻的基因組DNA作為模板， 采用所述正向引物和反向引物進行PCR擴增，通過檢測是否擴增得到SEQ ID N〇:l所示序 列或其片段，檢測所述水稻是否含有轉基因水稻品系134Bt來源的成分；和/或 依據SEQ ID N〇:2所示序列設計PCR擴增的正向引物和反向引物，以待檢測水稻的基 因組DNA作為模板，采用所述正向引物和反向引物進行PCR擴增，通過檢測是否擴增得到 SEQ ID N〇:2所示序列或其片段，檢測所述水稻是否含有轉基因水稻品系134Bt來源的成 分。
7. 根據權利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，依據SEQ ID No: 1中第1-246位 序列設計正向引物，依據SEQ ID No: 1所示序列中第247-502位序列設計反向引物； 優選地，所述正向引物為SEQ ID N〇:3所示序列，所述反向引物為SEQ ID N〇:4所示序 列。
8. 根據權利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，依據SEQ ID No:2中第1-298位 序列設計正向引物，依據SEQ ID N〇:2中第301-883位序列設計反向引物； 優選地，所述正向引物為SEQ ID No: 5所示序列，所述反向引物為SEQ ID No:6所示序 列。
9. 用于檢測如權利要求1所述的旁側序列的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列與 SEQ ID No: 1所示序列特異性退火； 優選地，所述DNA序列為PCR擴增SEQ ID No: 1所示序列的擴增引物； 更優選地，所述擴增引物為SEQ ID No:3所示的正向引物和SEQ ID No:4所示的反向 引物。
10. 用于檢測如權利要求2所述的旁側序列的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列與 SEQ ID No: 2所示序列特異性退火； 優選地，所述DNA序列為PCR擴增SEQ ID No: 2所示序列的擴增引物； 更優選地，所述擴增引物為SEQ ID No:5所示的正向引物和SEQ ID No:6所示的反向 引物。
11. 如權利要求9和/或10所述的DNA序列在檢測水稻或其制品中是否含有轉基因水 稻品系134Bt來源的成分中的用途。
12. 如權利要求9和/或10所述的DNA序列在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于 檢測水稻或其制品中是否含有轉基因水稻品系134Bt來源的成分。
13. 檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括如權利要求9和/或10所述的DNA 序列。
14. 如權利要求13所述的試劑盒在檢測轉基因水稻品系134Bt中的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388421SQ201410431657
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年8月28日 優先權日:2014年8月28日
【發明者】樸鐘澤, 楊瑞芳, 白建江, 方軍, 李鋼燮, 池鉉昭, 樸成韓, 林惠敏 申請人:上海市農業科學院, 韓國農業科學技術院