專利名稱：一種新的三萜合成酶的功能及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種新的三萜合成酶的功能及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
三萜化合物包括游離三萜和三萜皂苷，廣泛存在于高等植物中。三萜化合物是通過異戊二烯途徑來合成的，其生物合成路線為甲羥戊酸(Mevalonic acid)生成的異戊烯二磷酸(IPP)及其異構(gòu)體二甲基丙烯二磷酸(DAPP)在香草二磷酸合成酶(GPS)作用下首先形成香葉二磷酸(GPP)，接著利用法呢二磷酸合成酶(FPQ轉(zhuǎn)化成法呢二磷酸(FPP)，又在鯊烯合成酶(Squalene synthase, SQS)的作用下合成鯊烯，然后經(jīng)鯊烯環(huán)氧酶(Squalene 印oxidase，SQE)催化轉(zhuǎn)變?yōu)?，3_氧化鯊烯(2，3-oxidosqualene)。2，3_氧化鯊烯在氧化鯊烯環(huán)化酶(OSCs)的作用下環(huán)化形成三萜化合物的前體物質(zhì)，如β -香樹素(β -amyrin)。 目前已經(jīng)從擬南芥、水稻、苜蓿、百脈根等不同的植物中分離得到了幾十個編碼OSCs酶的基因，除了合成植物留醇的環(huán)阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase, CAQ，還包括 arabidiol synthase,(lupeol synthas,LUP)、βi^BI ( β -Amyrin synthase, β AS)、^|p二; 酉享(cucurbitadienol, CPQ) >thalianol synthase (THA) > marneral synthase (MRN)、camel1iol synthase(CAMS)、baruol synthase(BARS)、 isomultiflorenol synthase (IMS)等。另外，人們從雙子葉植物中發(fā)現(xiàn)了羊毛甾醇合成酶 (lanosterol synthase，LAQ，并證實在擬南芥中參與了植物留醇的合成。三萜化合物骨架在依賴細胞色素P450單加氧酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和酰基轉(zhuǎn)移酶進行氧化、糖基化及酰基化等化學修飾，最終獲得不同種類的三萜皂苷。眾所周知，三萜化合物是一種重要的天然藥物，例如，齊墩果酸具有降低轉(zhuǎn)氨酶的功能，臨床用于治療急性黃疸肝炎；人參皂苷具有增加白細胞數(shù)量、提高人體免疫力、促進物質(zhì)代謝、抗疲勞、抗衰老等作用。但三萜化合物的生物學功能的了解還非常少，例如燕麥在根尖合成的燕麥苷(avenacins)具有廣譜的抗菌功能，能防止多種病原菌侵染根部，發(fā)揮抗病作用。在水稻中發(fā)現(xiàn)有7個可編碼全長OSCs酶的基因序列，并鑒定了其中4個OSC基因的生化功能，它們分別是環(huán)阿屯醇合酶基因(0s02g04710/0s0SC3)，帕克醇(parkeol)合酶基因(0sllg08569/0s0SC9)，蓍醇 B (achilleol B)合酶基因(0sllgl81/0s0SC10)，以及異山苷子萜醇(isoarborinol)合酶基因(0sllg35710/0s0SC12)，還有一些OSC基因的功能
不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供OsOSCS蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明提供了 OsOSCS蛋白在制備三萜化合物中的應(yīng)用；所述OsOSCS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。所述三萜化合物的結(jié)構(gòu)式如下式I所示
權(quán)利要求
1.OsOSCS蛋白在制備三萜化合物中的應(yīng)用；所述OsOSCS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于 所述三萜化合物的結(jié)構(gòu)式如下式I所示式
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述OsOSCS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。
4.一種制備三萜化合物的方法，包括如下步驟1)將OsOSCS蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫睫D(zhuǎn)基因植物，2)提取步驟1)得到轉(zhuǎn)基因植物的葉片，收集提取產(chǎn)物，即得到三萜化合物； 所述OsOSCS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述蛋白的編碼基因通過重組載體導(dǎo)入目的植物；步驟2、中，所述提取步驟1)得到轉(zhuǎn)基因植物的葉片的方法包括如下步驟A、用裂解液裂解所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片，得到裂解產(chǎn)物、過濾，收集濾液；B、將步驟A得到的濾液用等體積正己烷萃取，收集正己烷層，再用等體積飽和Nacl水溶液洗滌，收集正己烷層，即得到三萜化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述OsOSCS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中得序列1 ； 所述重組載體為將所述OsOSCS蛋白的編碼基因插入表達載體pH7WG2D，l，得到表達所述蛋白的載體；步驟幻中，所述裂解液按照如下方法制備將Κ0Η、乙醇和水混合，得到裂解液，所述 KOH在所述裂解液中的濃度為10% (質(zhì)量百分含量)，所述乙醇在所述裂解液中的濃度為 80% (體積百分含量)；所述裂解液和所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片的配比為5L 500g； 所述裂解的溫度為80°C，所述裂解的時間為池； 所述三萜化合物的結(jié)構(gòu)式如下式I所示
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物。
8.OsOSCS蛋白在作為三萜化合物合成酶中的應(yīng)用； 所述OsOSCS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2 ；所述三萜化合物的結(jié)構(gòu)式如下式I所示
9.一種重組載體，為將OsOSCS蛋白的編碼基因插入表達載體pH7WG2D，1，得到表達所述蛋白的載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組載體，其特征在于所述OsOSCS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的三萜合成酶的功能及應(yīng)用。本發(fā)明提供的0s0SC8蛋白在制備三萜化合物中的應(yīng)用；所述0s0SC8蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供水稻中0s0SC8基因的生化功能為合成(3S，13S)-malabarica-17，21-dien-3β，14-diol，從而證明，0s0SC8基因編碼(3S，13S)-malabarica-17，21-dien-3β，14-diol合成酶。
文檔編號C12N15/52GK102321696SQ20111024799
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者劉丹, 段禮新, 漆小泉, 薛哲勇 申請人:中國科學院植物研究所