專利名稱：一種利用固定化β-葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法
技術領域：
本發明涉及酶工程技術領域，特別涉及一種利用固定化β-葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法。
背景技術：
龍膽低聚糖是一類由葡萄糖以β _1，6糖苷鍵結合的低聚糖。它不易消化，低熱值；對PH和熱較穩定，具有調節腸道菌群環境，增殖腸道有益菌群，改善通便效果等功能， 還具有柔和、特殊的提神苦味，用于果汁、糖果、冰淇淋等產品中可產生良好效果，因而被廣泛應用于保健食品等領域。目前制備龍膽低聚糖的方法較多，最早是從龍膽屬莖、根中提取的，由于受原料限制，難以大量生產。近年來，隨著酶法制備低聚糖的興起，工業生產龍膽低聚糖制品已成為可能。但利用游離酶制備龍膽低聚糖，酶難于回收，利用率低，也不利于產物低聚糖分離，生產成本高。酶在龍膽低聚糖的生產成本中占很大比重，因此降低酶的成本是降低總成本的關鍵。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種固定化β -葡萄糖苷酶的制備方法及利用固定化葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法，所制備的固定化葡萄糖苷酶能夠重復使用，利用率高，能夠有效的降低制備龍膽低聚糖的成本。為了實現上述目的，本發明一種利用固定化β -葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法采用如下技術方案一種利用固定化β -葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法，包括以下步驟1)黑曲霉固態發酵制備β -葡萄糖苷酶；2)采用交聯-包埋法固定化β -葡萄糖苷酶；3)利用固定化β -葡萄糖苷酶轉化葡萄糖生產龍膽低聚糖。所述步驟1)中，首先配制黑曲霉固態發酵培養基，按質量百分比加入黑曲霉，接種量為5%-10%，3(rC培養3-7d，形成發酵物；培養基組成為按質量份，麩皮120份，硫酸銨2. 7份，磷酸二氫鉀0. 72份，硫酸鎂1. 08份，蒸餾水240份；β -葡萄糖苷酶的制備取發酵物，用ΡΗ3. 4-4. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在 40-60°C浸提3次，過濾，再用20-35%飽和度的硫酸銨鹽析，除雜，取清液，再用70-80%飽和度的硫酸銨二次鹽析，然后再在4°C，離心力為lM00-25900Xg的條件下離心12-18min， 棄溶液，得β-葡萄糖苷酶。所述步驟2)中，β-葡萄糖苷酶的固定化工藝為取質量濃度為3. 0-5.0%海藻酸鈉AmL和酶活為35-50U的β -葡萄糖苷酶液BmL，充分混合后，加入體積濃度為25 %的戊二醛CmL，混勻，4°C交聯3- ；將交聯后的溶液勻速滴入質量濃度為1. 0-2. 5% CaCl2溶液中，4°C硬化2-5小時；濾出凝膠球即為固定化β -葡萄糖苷酶，用pH3. 4-4. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液沖洗，并4°C保存于pH3. 4-4. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，備用；其中 A B C = 10 2 0. 8。用pH3. 4-4. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液沖洗凝膠球，并4°C保存于pH3. 4-4. 8 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，備用。所述步驟幻中的固定化酶轉化葡萄糖生產龍膽低聚糖的工藝為配制質量濃度為50% -80%葡萄糖緩沖溶液，其pH值為3. 4-4.8 ；將固定化 β -葡萄糖苷酶加入反應柱中，測定反應柱中固定化β -葡萄糖苷酶的酶活力，按30-60U/ g(反應柱中總的酶或除以30-60U，即為反應柱中需要加入葡萄糖緩沖液的克數)的比例加葡萄糖于反應柱中，55-65°C反應36-7池，移出反應液即為龍膽低聚糖與葡萄糖的混合液。步驟幻中還包括將龍膽低聚糖從龍膽低聚糖與葡萄糖的混合液中分離出來的步馬聚ο步驟幻中還包括以下步驟測定移出反應液后反應柱中固定化β -葡萄糖苷酶的活力，按照30-60U/g的比例加入新的葡萄糖緩沖溶液于反應柱中進行反應。本發明所制固定酶可連續使用4-6批次，其酶活保持不變。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明制備的固定化酶的酶回收率可達50-60% ；固定化酶對底物葡萄糖的轉化率可達45% ；固定化葡萄糖苷酶，可反復使用4-6次，顯著提高了酶的利用率，降低了生產成本；固定化酶對環境耐受力較游離酶顯著提高游離酶耐受ΡΗ2. 8-5. 5，耐受溫度 40-700C。固定化酶耐受ρΗ2. 8-7. 0，耐受溫度30_80°C ；降低了產物分離難度；轉化反應可連續進行，適合大規模連續化生產。
具體實施例方式下面將結合具體的固定化工藝和生產龍膽糖的工藝對本發明做進一步的說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。符合本發明的利用固定化葡萄糖苷酶轉化葡萄糖，制備龍膽低聚糖的方法按照以下步驟進行實施例1 1)配制黑曲霉固態發酵培養基，按質量百分比加入黑曲霉，接種量為5%，3(TC 培養3d形成發酵物。培養基組成為麩皮120g，硫酸銨2.7g，磷酸二氫鉀0.72g，硫酸鎂 1. 08g,蒸餾水MOmL。酶的制備取發酵物，用pH3. 4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在40°C 浸提3次，過濾，20%飽和度的硫酸銨鹽析，除雜，取清液，再用70%飽和度的硫酸銨二次鹽析，4°C離心12min，離心力為IMOO X g，棄溶液，得β-葡萄糖苷酶。(2)采用交聯-包埋法固定β-葡萄糖苷酶的工藝為取質量濃度為3.0%海藻酸鈉7. 2mL和酶活為37U的β -葡萄糖苷酶液2mL，充分混合后，加入體積濃度為25%戊二醛 0. 8mL,混勻，4°C交聯3h。將上述溶液勻速滴入質量濃度為1. 5% CaCl2溶液中，4°C硬化5h。 濾出凝膠球，用PH3. 4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液沖洗，并4°C保存于pH3. 4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，備用。(3)利用固定化葡萄糖苷酶轉化葡萄糖生產龍膽低聚糖的工藝為配制質量濃度為50%葡萄糖緩沖溶液(ρΗ3. 4)，按30U/g葡萄糖的比例加酶于反應柱中，55°C反應 36h，移出反應液即為龍膽低聚糖與葡萄糖的混合液。加入新的葡萄糖緩沖溶液進行反應。本發明所制固定酶可連續使用4批次，其酶活保持不變。實施例2 1)配制黑曲霉固態發酵培養基，按質量百分比加入黑曲霉，接種量為8. 5%，30°C 培養4d形成發酵物。培養基組成為麩皮1200g，硫酸銨27g，磷酸二氫鉀7. 2g，硫酸鎂 10. 8g，蒸餾水MOOmL。酶的制備取發酵物，用PH3. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在45°C 浸提3次，過濾，30%飽和度的硫酸銨鹽析，除雜，取清液，再用75%飽和度的硫酸銨二次鹽析，4°C離心15min，離心力為13400 X g，棄溶液，得β -葡萄糖苷酶。2)取取質量濃度為3. 6%海藻酸鈉7. 2mL和酶活為46U的β -葡萄糖苷酶液2mL， 充分混合后，加入體積濃度為25%戊二醛0. 8mL,混勻，4°C交聯3. 5h。將上述溶液勻速滴入質量濃度為2. 0% CaC12溶液中，4°C硬化池。濾出凝膠球，用pH3. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液沖洗，并4°C保存于pH3. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，備用。3)配制質量濃度為70%葡萄糖緩沖溶液(PH3.8)，按60U/g葡萄糖的比例加酶于反應柱中，65°C反應48h，移出反應液即為龍膽低聚糖與葡萄糖的混合液。加入新的葡萄糖緩沖溶液進行反應。本發明所制固定酶可連續使用6批次，其酶活保持不變。實施例3 1)配制黑曲霉固態發酵培養基，按質量百分比加入黑曲霉，接種量為10%，3(TC 培養7d形成發酵物。培養基組成為麩皮12000g，硫酸銨270g，磷酸二氫鉀72g，硫酸鎂 108g,蒸餾水MOOOmL。酶的制備取發酵物，用pH4. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在60°C 浸提3次，過濾，35%飽和度的硫酸銨鹽析，除雜，取清液，再用80%飽和度的硫酸銨二次鹽析，4°C離心18min，離心力為25900 X g，棄溶液，得β-葡萄糖苷酶。2)取質量濃度為5. O %海藻酸鈉7. 2mL和酶活為70U的β -葡萄糖苷酶液2mL，充分混合后，加入體積濃度為25%戊二醛0. 8mL，混勻，4°C交聯4h。將上述溶液勻速滴入質量濃度為2. 5% CaCl2溶液中，4°C硬化池。濾出凝膠球，用pH4. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液沖洗，并4°C保存于pH4. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，備用。3)配制質量濃度為80%葡萄糖緩沖溶液(PH4.8)，按50U/g葡萄糖的比例加酶于反應柱中，60°C反應72h，移出反應液即為龍膽低聚糖與葡萄糖的混合液。加入新的葡萄糖緩沖溶液進行反應。本發明所制固定酶可連續使用6批次，其酶活保持不變。
權利要求
1.一種利用固定化β-葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法，其特征在于，包括以下步驟1)黑曲霉固態發酵制備β-葡萄糖苷酶；2)采用交聯-包埋法固定化β-葡萄糖苷酶；3)利用固定化葡萄糖苷酶轉化葡萄糖生產龍膽低聚糖。
2.根據權利要求1所述的一種利用固定化葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法，其特征在于所述步驟1)中，首先配制黑曲霉固態發酵培養基，按質量百分比加入黑曲霉，接種量為5%-10%，301培養3-7(1，形成發酵物；培養基組成為按質量份，麩皮120份，硫酸銨2. 7份，磷酸二氫鉀0. 72份，硫酸鎂1. 08份，蒸餾水240份；β-葡萄糖苷酶的制備取發酵物，用ΡΗ3. 4-4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在 40-60°C浸提3次，過濾，再用20-35%飽和度的硫酸銨鹽析，除雜，取清液，再用70-80%飽和度的硫酸銨二次鹽析，然后在4°C，離心力為1M00-25900 X g的條件下離心12-18min，棄溶液，得β-葡萄糖苷酶。
3.根據權利要求1所述的一種利用固定化葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法，其特征在于所述步驟幻中，β -葡萄糖苷酶的固定化工藝為取質量濃度為3. 0-5. 0%海藻酸鈉AmL和酶活為35-70U的β -葡萄糖苷酶液BmL，充分混合后，加入體積濃度為25 %的戊二醛CmL，混勻，4°C交聯3- ；將交聯后的溶液勻速滴入質量濃度為1. 0-2. 5% CaCl2溶液中，4°C硬化2-5小時；濾出凝膠球即為固定化β -葡萄糖苷酶，用pH3. 4-4. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液沖洗，并4°C保存于pH3. 4-4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，備用；其中 A B C = 7. 2 2 0. 8。
4.根據權利要求3所述的一種利用固定化葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法，其特征在于，所述步驟2)中，用ρΗ3. 4-4. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液沖洗凝膠球，并4°C保存于pH3. 4-4. 8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，備用。
5.根據權利要求1所述的一種利用固定化葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法，其特征在于所述步驟幻中的固定化酶轉化葡萄糖生產龍膽低聚糖的工藝為配制質量濃度為50% -80%葡萄糖緩沖溶液，其ρΗ值為3. 4-4. 8 ；將固定化β -葡萄糖苷酶裝入反應柱中，測定反應柱中固定化葡萄糖苷酶的酶活力，按30-60U/g的比例添加葡萄糖于反應柱中，55-65°C反應36-7池，移出反應液，即為龍膽低聚糖與葡萄糖的混合液。
6.根據權利要求5所述的一種利用固定化葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法，其特征在于，步驟幻中還包括將龍膽低聚糖從龍膽低聚糖與葡萄糖的混合液中分離出來的步驟。
7.根據權利要求5所述的一種利用固定化葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法，其特征在于，步驟幻中還包括以下步驟測定移出反應液后反應柱中固定化葡萄糖苷酶的活力，按照30-60U/g的比例繼續加入新的葡萄糖緩沖溶液于反應柱中進行反應。
全文摘要
本發明公開了一種利用固定化β-葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法，利用固定化β-葡萄糖苷酶制備龍膽低聚糖的方法包括以下步驟1)黑曲霉固態發酵制備β-葡萄糖苷酶；2)采用交聯-包埋法固定化β-葡萄糖苷酶；3)利用固定化β-葡萄糖苷酶轉化葡萄糖生產龍膽低聚糖。該方法制備固定化酶的酶活回收率最高可達60％，固定化酶對底物葡萄糖的轉化率可達45％；固定酶的穩定性及pH耐受性顯著提高，機械強度好，可連續重復使用4-6批次，酶活保持不變。本發明提高了酶法生產龍膽糖酶的利用率，降低了生產成本和龍膽糖分離純化難度，適合大規模連續化生產，對提高我國生產龍膽低聚糖的技術水平具有重要意義。
文檔編號C12N9/24GK102321707SQ201110293398
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者張雯, 王艷麗, 王釧, 齊香君 申請人:陜西科技大學