專利名稱：榛子葉片和花芽總rna提取方法
技術領域：
本發明涉及一種從植物組織中提取總RNA的方法，特別涉及一種從富含多糖、多酚、蛋白質等次生代謝產物的植物組織中提取總RNA的方法。
背景技術：
榛屬于榛科(Corylaceae)榛屬(Corylus L)樹種，是珍貴的木本糧油資源，榛仁含脂肪、蛋白質、碳水化合物、還含有維生素C、E和多種礦物質，榛子的果殼可以作為制造活性碳的原料。樹皮和果苞含單寧，可制栲膠，榛子樹葉、樹皮和果仁中發現有抗癌物紫杉醇，具有很高的經濟價值(張宇和，柳鎏，等.中國果樹志[M].北京中國林業出版社.2005 :1148.聶洪超，孫萬河，等.雜交榛子生產上存在的問題及發展建議[J].北方果樹· 2010，(6) :46-47.)。近年來，隨著分子生物學的日益普及，國內外也逐漸開始利用分子生物學手段SSR(魏鑫，魏永祥，王穎，等.平歐雜種榛ISSR反應體系的優化與驗證[J].北方園 藝.2010, (4) 125-128. Kahraman Giircan, Shawn A. Mehlenbacher. Development ofmicrosatellite marker loci for European hazelnut (Corylus aveliana L.) from ISSRfragments[J], Mol Breeding. 2010, (26) :551-559.)、RAPD(Shawn A. Mehlenbacher, Rebecca N. Brown, Eduardo R. Nouhra, Tufan Giikirmak, Nahla V. Bassil, ThomasL. Kubisiak. A genetic linkage map for hazelnut(Corylus avellana L. )based on RAPD andSSR markers [J]. Genome. 2006，(49) :122-133.)、RT-PCR 以及免疫組織定位 (D. Rigola, Μ. Ε. Pe, Μ. Sari-Gorla. A cDNA clone from hazelnut(Corylus avellana L.) encoding a lowmolecular weight heat shock protein expressed in the reproductive structures [J], Sex PlantReprod. 1998, (11) J9-30.)等技術對榛子的物種遺傳多樣性、 親緣關系、基因克隆、蛋白定位等進行研究。而從榛子中提取高質量的總RNA是進行這些研究的基礎和關鍵。榛子葉片以及花芽富含多糖、多酚、蛋白質等次生代謝產物，多糖的很多理化性質與RNA相似，很難將其分開，而多酚易被氧化成褐色的醌類物質，會使RNA降解，RNase和多酚氧化酶都屬于蛋白質，要獲得完整的、高質量的總RNA就必須能夠去除蛋白，次生代謝產物則易與RNA結合，阻礙RNA的分離。因此，去除多糖、蛋白和次生代謝物質、抑制多酚的氧化是榛子總RNA提取成敗的關鍵。

發明內容
本發明的目的是提供一種從植物組織中提取總RNA的方法，該方法特別適用于從富含多糖、多酚、蛋白質等次生代謝產物的植物組織榛子中提取總RNA。本發明所提供的從植物組織中提取總RNA的方法稱為改良CTAB法，包括如下步驟1)將植物組織樣品與聚乙烯吡咯烷酮和維生素C混合后，再加入液氮研磨成粉末；所述植物組織樣品、所述聚乙烯吡咯烷酮和所述維生素C的配比為 0. 2g 0. Olg 0. Olg ；2)將步驟1)得到的粉末加入到55-65°C的提取液中，55-65°C水浴lOmin，得到樣
品混合液；所述提取液的溶劑為水(DEPC與水體積比為1 1000的DEPC水)，溶質為十六烷基三甲基溴化銨、Tris-Cl、乙二胺四乙酸、三鹽酸亞精胺、聚乙烯咯烷酮(簡寫PVP，分子式(C6H9N0)n) ；Solarbio公司的，商品目錄號是P^90，分子量:40000 ；純度> 99% )、氯化鈉、β-巰基乙醇；所述十六烷基三甲基溴化銨在所述提取液中的含量為每IOOml所述提取液中含有3g所述十六烷基三甲基溴化銨，所述Tris-Cl的終濃度為IOOmM(ρΗ8. 0)，所述乙二胺四乙酸的終濃度為25mM(pH8. 0)，所述三鹽酸亞精胺在所述提取液中的含量為每 IOOml所述提取液中含有0. 05g所述三鹽酸亞精胺，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述提取液中的含量為每IOOml所述提取液中含有3g所述聚乙烯吡咯烷酮，所述氯化鈉的終濃度為2M, 所述β-巰基乙醇的終濃度為體積百分含量5%。由于β-巰基乙醇易降解，在配制所述提取液時，巰基乙醇在所述提取液使用之前(水浴之后加入樣品之前加到提取液中)加入。3)對步驟2)得到的樣品混合液進行RNA的抽提和RNA的沉淀，得到總RNA ；所述抽提為用氯仿/異戊醇進行的抽提；所述氯仿/異戊醇是由氯仿與異戊醇按照M 1的體積比混合得到的混合物。在本發明的實施例中，所述植物樣品具體為按照如下方法得到的樣品將新鮮的的植物組織置于液氮中速凍后-80°C保存(抑制內源RNase的活性)，得到所述植物組織樣
P
ΡΠ O所述氯仿/異戊醇在抽提體系中體積百分含量可為50%。步驟幻中所述RNA的沉淀包括用LiCl對所述RNA進行沉淀的步驟；所述LiCl在沉淀體系中的終濃度為2M。步驟3)中所述RNA的沉淀還包括用無水乙醇對所述RNA進行沉淀的步驟。在本發明的實施例中，所述RNA的抽提和所述RNA的沉淀具體包括如下步驟a)向所述樣品混合液中加入等體積的所述氯仿/異戊醇，混勻，于4°C 12000r/min 離心lOmin，回收上清液；b)向步驟a)得到的上清液中加入等體積的所述氯仿/異戊醇，混勻，于4°C， 12000r/min離心lOmin，回收上清液；c)向步驟b)得到的上清液中加入LiCl，使其終濃度為2M，混勻后于4°C放置過夜，于4°C 12000r/min離心30min，得到RNA沉淀；d)將步驟c)所得的RNA沉淀用75%乙醇清洗，得到總RNA的粗提物；e)將步驟d)得到的總RNA的粗提物用SSTE緩沖液溶解，加入等體積的所述氯仿/異戊醇，混勻，于4°C，12000r/min離心lOmin，回收上清液；所述SSTE緩沖液的溶劑為水(DEPC與水體積比為1 1000的DEPC水)，溶質為NaCl、十二烷基磺酸鈉、Tris-Cl 和EDTA ；所述NaCl的終濃度為0. 5M，所述十二烷基磺酸鈉在所述SSTE緩沖液中的含量為每IOOml所述SSTE緩沖液中含有0. 5g所述十二烷基磺酸鈉，所述Tris-Cl的終濃度為 IOmM (ρΗ8. 0)，所述 EDTA 的終濃度為 ImM (ρΗ8. 0)。f)向步驟e)得到的上清液中加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，于_20°C放置,于 4°C 12000r/min 離心 30min，得到 RNA 沉淀；g)將步驟f)得到的RNA沉淀用75%乙醇洗兩次，再用無水乙醇洗一次，自然干燥，溶于100 μ 1 DEPC水，得到所述總RNA。本發明的另一個目的是提供一種從植物組織中提取總RNA的提取液。本發明所提供的提取液的溶劑為水(DEPC與水體積比為1 1000的DEPC水)， 溶質為十六烷基三甲基溴化銨、Tris-Cl、乙二胺四乙酸、三鹽酸亞精胺、聚乙烯吡咯烷酮、 氯化鈉、β -巰基乙醇；所述十六烷基三甲基溴化銨在所述提取液中的含量為每IOOml所述提取液中含有3g所述十六烷基三甲基溴化銨，所述Tris-Cl的終濃度為IOOmM(pH8. 0)，所述乙二胺四乙酸的終濃度為25mM(pH8. 0)，所述三鹽酸亞精胺在所述提取液中的含量為每 IOOml所述提取液中含有0. 05g所述三鹽酸亞精胺，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述提取液中的含量為每IOOml所述提取液中含有3g所述聚乙烯吡咯烷酮，所述氯化鈉的終濃度為2M, 所述β-巰基乙醇的終濃度為體積百分含量5%。由于β-巰基乙醇易降解，在配制所述提取液時，β-巰基乙醇在所述提取液使用之前加入。所述植物組織可為富含多糖、多酚、蛋白質等次生代謝產物的植物組織。在本發明的實施例中，所述植物組織具體為榛子組織，如榛子的幼葉、雄花芽或成熟葉片。本發明所提供的改良CTAB法，提取液中3% (w/v)的CTAB可以使蛋白質變性凝聚，進一步用氯仿抽提去除蛋白質；提取液中β-巰基乙醇、PVP的濃度分別加大至5% (ν/ v)>3% (w/v)，還加入了 0.05% (w/v)三鹽酸亞精胺，這抑制了酚類的氧化，并去除未氧化的酚類化合物；提取液中用了高濃度的NaCl，沉淀步驟使用了高濃度的LiCl將部分多糖留在上清液中，通過氯仿抽提可以除去一些多糖。這些試劑增強了榛子植物組織的裂解能力， 提供了還原條件，使RNase活性抑制和變性的物質強力抑制了多酚的氧化，在一定程度上去除蛋白、多糖的效果顯然非常好，此法提到的總RNA產量也比較高。實驗證明，與CTAB法和改良SDS法相比，本發明所提供的改良CTAB法更適合榛子總RNA的提取，所獲得的榛子葉片和雄花芽總RNA完整性更好，檢查得出純度和產量更高以及蛋白、多糖和酚類物質去除也更加徹底。所獲得的總RNA能夠滿足后續試驗的需求，是一種比較理想的榛子幼葉和雄花芽總RNA提取方法，隨著榛子葉片不斷成熟，各種水解酶大量積累，多酚和多糖的含量也隨之增加，因此榛子成熟葉片總RNA的提取難度更大，成熟葉片的效果較嫩葉和雄花芽稍差一些，但提取效果仍明顯優于CTAB法和改良SDS法。


圖1為榛子幼葉總RNA樣品的電泳結果。其中，A為改良CTAB法提取結果(泳道 1-3為3個重復)；B為CTAB法提取結果(泳道1-2為2個重復)；C為改良SDS法提取結果(泳道1-2為2個重復)。圖2為榛子雄花芽總RNA樣品的電泳結果。其中，A為改良CTAB法提取結果(泳道1-3為3個重復)；B為CTAB法提取結果；C為改良SDS法提取結果(泳道1_2為2個重復)。圖3為榛子成熟葉片總RNA樣品的電泳結果。其中，A為改良CTAB法提取結果 (泳道1-2 ；B為CTAB法提取結果(泳道3-5為3個重復)；C為改良SDS法提取結果(泳道1-2為2個重復)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。溶液的配制(I)DEPC水1000ml超純水中加入1000 μ 1焦碳酸二乙酯(DEPC)，搖勻，通風櫥中過夜，第二天早上搖勻，121°C濕熱滅菌lh，搖勻，冷卻后備用，以下用到的所有溶液都需要用 0. (v/v) DEPC 水配制。(2) IM Tris-Cl (pH = 8. 0) 500ml 稱 60. 5g Tris-Cl 溶于約 400ml DEPC 水中，濃鹽酸調節PH至8. 0，定容至500ml。(3) 0. 5M EDTA (pH = 8. 0) 500ml 稱取 93. 05g Na2EDTA · 2H20 禾口 IOgNaOH,溶于 350ml DEPC水，溶解后，用5M的NaOH (DEPC水溶液)調節pH至8. 0，定容至500ml。(4) 5M NaCl :146g NaCl 溶于 500ml DEPC 水中。(5) 10% SDS 500ml :50gSDS，溶解于 500ml DEPC 水中。(6) IOM LiCl 200ml :84. 8g 無水氯化鋰溶于 200ml DEPC 水中。(7)改良CTAB的提取液終濃度為3% (w/v)的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、 終濃度為IOOmM Tris-Cl (pH8. 0)、終濃度為25mM的乙二胺四乙酸(EDTA) (pH8. 0)、終濃度為2M的NaCl、終濃度為3% (w/v)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP) (Solarbio公司，商品目錄號是 P^90，分子量40000 ；純度> 99% )、終濃度為0. 05% (w/v)的三鹽酸亞精胺、終濃度為 5% (體積百分含量)的巰基乙醇(易降解，使用時現加)。(8) SSTE緩沖液終濃度為0. 5Μ的NaCl、終濃度為0. 5% (w/v)的十二烷基磺酸鈉(SDS)、終濃度為 IOmM 的 Tris-Cl (pH = 8. 0)、終濃度為 ImM 的 EDTA(pH = 8. 0)。(9) 10 X RNA上樣緩沖液(IOXloading buffer)終濃度為60% (體積百分含量) 的甘油、終濃度為0.25% (w/v)的溴酚藍、終濃度為IOmM的EDTA(pH = 8.0)、終濃度為 IOOmM 的 Tris-Cl (pH = 8. 0)，使用時用 DEPC 處理水稀釋成 1 X loading buffer。(10) 10XTBE 稱取 108g Tris, 7. 44g Nei2EDTA ·2Η20，55g硼酸，溶于 800ml 的 DEPC 水中，攪勻；用NaOH調節pH8. 3，DEPC處理水定容至1L，室溫保存。使用時稀釋成1XTBE。塑料制品和玻璃器皿的滅菌處理塑料制品和玻璃器皿都121 °C，高壓滅菌60min，最好使用進口的槍頭及離心管；電泳槽、制膠槽以及梳子用0. 5M EDTA和5M NaOH(0. 5M EDTA 500ul、5M NaOH 5ml、DEPC 水定容至 250ml)浸泡 2 小時，75% 乙醇沖洗， 晾干備用；用75%的乙醇拭擦移液槍內部和外部。24X1. 5/2ml離心管使用離心機型號Sorval Primo-R臺式高速冷凍離心機； 6X50ml離心管使用離心機型號德國heraeus Bifuge Stratos全能臺式高速離心機。實施例1、從榛子幼葉提取總RNA樣品及其鑒定一、榛子幼葉總RNA樣品的提取試驗地設在位于北京市西郊鶩峰林場實驗基地。2010年春季3月底，采集平歐雜交榛達維(育種代號84-2M)(張宇和，柳鎏，等.中國果樹志板栗榛子卷[M].北京中國林業出版社.2005 :1-248.)帶芽枝條帶回室內得到水培幼葉。下面將詳述如何利用改良CTAB法從榛子幼葉提取較高質量的總RNA樣品，具體操作步驟如下1)采樣2010年3月底采集榛子(平歐雜交榛達維，育種代號84_254)帶芽枝條室內水培，一周后采集水培抽出的幼葉，將其經液氮速凍后立即置于-80°C冰箱中保存(液氮速凍的目的是抑制內源RNase的活性)，得到樣品1 ；2)向50ml無菌離心管中加入IOml改良CTAB提取液，于65°C水浴鍋中預熱約 IOmin ；3)取約0. 2g步驟1)制備的樣品1，置于預冷的研缽中，加入少量聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)和維生素C (PVP和維生素C各0. Olg)，用液氮充分研磨成粉，得到樣品2 ；4)迅速將步驟3)研好的粉末(樣品2)倒入步驟2)預熱的改良CTAB提取液中， 65°C水浴lOmin，期間振蕩1次，使其混勻，得到樣品混合液3 ；5)向步驟4)得到的樣品混合液3中加入等體積的氯仿異戊醇(氯仿/異戊醇體積比為24 1)，混勻，于40C 12000r/min離心IOmin,回收上清液；6)向步驟幻得到的上清液中加入等體積氯仿與異戊醇的體積比為M 1的氯仿 /異戊醇，混勻，于40C 12000r/min離心IOmin,回收上清液；7)向步驟6)得到的上清液中加入1/4體積的IOM的LiCl，混勻后于4°C放置過夜，于4°C 12000r/min離心30min，得到RNA沉淀；8)將步驟7)所得的RNA沉淀用預冷的75%乙醇清洗，得到總RNA的粗提物；9)將步驟8)得到的總RNA的粗提物用SSTE緩沖液(如果用的是1. 2ml的離心管，加500ul即可；一般是加所用離心管的2/5體積即可)溶解，加入等體積的氯仿與異戊醇的體積比為M 1的氯仿/異戊醇混勻，于4°C 12000r/min離心lOmin，回收上清液；10)向步驟9)得到的上清液中加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，于_20°C放置 2h,于 4°C 12000r/min 離心 30min，得到 RNA 沉淀；11)將步驟10)得到的RNA沉淀用預冷的75%乙醇洗兩次，再用預冷的無水乙醇洗一次，自然干燥5min(時間不宜太長，否則RNA不易溶解)，溶于100 μ 1 DEPC水，混勻， 于-80°C保存備用(可長期保存于2倍無水乙醇中)，總RNA樣品不易降解。同時以CTAB法和改良SDS法作為對照。其中，所述CTAB法所用提取液配方為終濃度為2% (w/v)的CTAB ；終濃度為IOOmM的Tris-Cl ；終濃度為25mM的EDTA ；終濃度為 2% (w/v)的PVP ；終濃度為O. 05% (w/v)的三鹽酸亞精胺；終濃度為2% (ν/ν)的β -巰基乙醇。具體的提取步驟如下(1) 1. 5ml無菌離心管中加入600 μ 1提取液于65°C水浴鍋中預熱15min ； (2)預冷研缽中放入0. Ig植物材料，加少量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和維生素 C(PVP和維生素C各0. Olg)，用液氮將0. Ig葉片研磨成細末；(3)迅粉速將研后的細末裝到預熱的提取液中，65°C水浴IOmin ； (4)加等量體積的氯仿異戊醇04 1)，振蕩IOmin ； (5)4°C，12000r/min離心15min ； (6)取上清，加等量的氯仿異戊醇重復抽提，4°C，12000r/ min離心IOmin ； (7)收集上清液，加1/4體積IOM的LiCl，混勻，4°C過夜；(8) 4°C, 12000r/ min離心30min ;(9)棄上清，DEPC水溶解沉淀，加入等體積氯仿異戊醇抽提；(10)4°C， 12000r/min離心15min ； (11)收集上清，加2倍體積無水乙醇于_20°C或冰上中放置濁，沉淀總RNA ； (12)4°C 12000r/min離心30min ； (13)棄上清75%乙醇洗2次，無水乙醇沖洗一遍，超凈臺自然干燥15min ； (14)加入50 μ 1無RNAse的水溶解沉淀，_80°C保存備用。改良SDS法提取液的配方為終濃度為50mM的1Tris-HCl (ρΗ8. 0)，終濃度為0. 2M的NaCl ；終濃度為25mM的EDTA ；終濃度為4% (W/V)的SDS ；終濃度為3% (W/V)的PVP ；終濃度為15% (ν/ν)的乙醇；終濃度為5% (ν/ν)的β -巰基乙醇。具體的提取步驟如下(1) 取0. Ig葉片于研缽中，加少量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和維生素C(PVP和維生素C各O.Olg)， 加入液氮研磨成粉末狀；⑵轉入加有Iml 65°C預熱的提取液中；(3)加入Iml酚氯仿 異戊醇05 24 1)，渦旋振蕩混勻J4)4°C 12000r/min離心15min ;(5)取上清，加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)，充分混勻；(6)4°C 12000r/min離心15min ;(7)取上清，加入 1/4 體積 IOM 的氯化鋰，-20°C放置 2-3h 或 4°C過夜；(8)4°C 12000r/min 離心 30min ； (9)用 75%乙醇清洗，DEPC水溶解沉淀，加入等體積氯仿異戊醇04 1)抽提；(10) 4°C 120001·/ min離心15min ； (11)收集上清，加1/10體積3M NaAc和2. 5倍體積的無水乙醇，_20°C放置2-3h ;(12)4°C 12000r/min離心30min，棄上清，75%乙醇洗沉淀2次；(13)于通風櫥中干燥后溶于50 μ 1無RNAse的水中，_80°C保存備用。二、榛子幼葉總RNA樣品的鑒定利用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA提取好壞，主要依據^SrRNA與18SrRNA電泳譜帶的特征。如果帶型清晰且亮，28SrRNA亮度高于18SrRNA，且約是18SrRNA的2倍，則表明所提取到的總RNA量大、質量高、未降解。利用分光光度計檢測所提取的總RNA樣品的濃度和純度，若0擬60/280在1. 8-2. 0之間，說明所提的總RNA較純，無其他雜質的污染。1、榛子幼葉總RNA完整性的檢測取1 μ 1上述步驟一提取的總RNA樣品，進行瓊脂糖凝膠IXTBE電泳檢測。由圖1所示，本發明所提供的改良CTAB法提取的榛子幼葉總RNA樣品，點樣孔干凈，條帶清晰，無拖尾，所提到的RNA較完整，且^SrRNA亮度是18SrRNA的2倍，說明提取過程中沒有降解現象發生，而且在電泳檢測中看不到蛋白質和多糖污染，所提的RNA純凈。而CTAB法提取的榛子幼葉總RNA，條帶也比較清晰，28SrRNA亮度與18SrRNA相當，說明^SrRNA降解明顯，條帶有拖尾現象，DNA污染嚴重，有蛋白質、多糖等雜質污染，產量也較少；改良SDS法提取的榛子幼葉總RNA，不完整，28SrRNA降解明顯，條帶有拖尾，DNA、蛋白質、多糖等雜質污染嚴重。2、榛子幼葉總RNA濃度和純度的檢測上述步驟1以瓊脂糖凝膠IXTBE電泳檢測榛子幼葉總RNA完整性，其結果表明改良CTAB法提取榛子幼葉總RNA樣品的效果比較好。以下為利用分光光度計檢測上述步驟一改良CTAB法和改良SDS法各自提取的榛子幼葉總RNA樣品的OD值，進一步比較這兩種方法提取的產率和質量。結果如表1所示，改良CTAB法和改良SDS法所提取的幼葉的0皿60/280分別為 2. 04和1. 80，在1. 8-2. 0之間，說明這兩種方法方法所提取的RNA純度較高，DNA、蛋白質和多糖污染少。但是，在RNA產率上看，改良CTAB法(每克榛子幼葉提取Ml. 57 yg總RNA) 遠比改良SDS法(每克榛子幼葉提取111. 8μ g總RNA)高。本實施例的結果表明，綜合上述三種方法，改良CTAB法、CTAB法和改良SDS法都能從榛子幼葉中提取到總RNA，相比較而言，改良CTAB法所提的總RNA較完整，條帶清晰，得到了較高質量的RNA ；同時改良CTAB法所提取的總RNA樣品的產率也較高(每克榛子幼葉提取Ml. 57 μ g總RNA)，這說明本發明所提供的改良CTAB法適合于榛子幼葉總RNA的提取。實施例2、從榛子雄花芽提取總RNA樣品及其鑒定
一、榛子雄花芽總RNA樣品的提取試驗地設在位于北京市西郊鶩峰林場實驗基地。2010年8月，采集平歐雜交榛達維(育種代號84-2M)(張宇和，柳鎏，等.中國果樹志板栗榛子卷[M].北京中國林業出版社.2005 1-248.)雄花芽。下面將詳述如何利用改良CTAB法從榛子雄花芽提取較高質量的總RNA樣品，具體操作步驟如下1)采樣2010年7月初采集榛子(平歐雜交榛達維，育種代號84_254)雄花芽，將其經液氮速凍后立即置于-80°C冰箱中保存(抑制內源RNase的活性)，得到樣品1 ；2)向50ml無菌離心管中加入IOml改良CTAB提取液，于65°C水浴鍋中預熱約 IOmin ；3)取約0. 2g步驟1)制備的樣品1，置于預冷的研缽中，加入少量聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)和維生素C (PVP和維生素C各0. Olg)，用液氮充分研磨成粉，得到樣品2 ；4)迅速將步驟3)研好的粉末(樣品2)倒入步驟2)預熱的改良CTAB提取液中， 65°C水浴lOmin，期間振蕩1次，使其混勻，得到樣品混合液3 ；5)向步驟4)得到的樣品混合液3中加入等體積的氯仿與異戊醇的體積比為 24 1的氯仿/異戊醇，混勻，于4°C 12000r/min離心lOmin，回收上清液；6)向步驟幻得到的上清液中加入等體積氯仿與異戊醇的體積比為M 1的氯仿 /異戊醇，混勻，于40C 12000r/min離心IOmin,回收上清液；7)向步驟6)得到的上清液中加入1/4體積的IOM的LiCl，混勻后于4°C放置過夜，于4°C 12000r/min離心30min，得到RNA沉淀；8)將步驟7)所得的RNA沉淀用預冷的75%乙醇清洗，得到總RNA的粗提物；9)將步驟8)得到的總RNA的粗提物用SSTE緩沖液(如果用的是1. 2ml的離心管，加500ul即可；一般是加所用離心管的2/5體積即可)溶解，加入等體積的氯仿與異戊醇(氯仿/異戊醇體積比為對1)，混勻，于4°C 12000r/min離心lOmin，回收上清液；10)向步驟9)得到的上清液中加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，于_20°C放置 2h,于 4°C 12000r/min 離心 30min，得到 RNA 沉淀；11)將步驟10)得到的RNA沉淀用預冷的75%乙醇洗兩次，再用預冷的無水乙醇洗一次，自然干燥5min(時間不宜太長，否則RNA不易溶解)，溶于100 μ 1 DEPC水，混勻， 于-80°C保存備用(可長期保存于2倍無水乙醇中)，總RNA樣品不易降解。同時以CTAB法和改良SDS法作為對照(具體方法同實施例1)。二、榛子雄花芽總RNA樣品的鑒定利用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA提取好壞，主要依據^SrRNA與18SrRNA電泳譜帶的特征。如果帶型清晰且亮，28SrRNA亮度高于18SrRNA，且約是18SrRNA的2倍，則表明所提取到的總RNA量大、質量高、未降解。利用分光光度計檢測所提取的總RNA樣品的濃度和純度，若O擬60/280在1. 8-2. O之間，說明所提的總RNA較純，無其他雜質的污染。1、榛子雄花芽總RNA完整性的檢測取1 μ 1上述步驟一提取的總RNA樣品，進行1 %瓊脂糖凝膠1 X TBE電泳檢測。由圖2所示，本發明所提供的改良CTAB法提取的榛子雄花芽總RNA樣品，點樣孔干凈，條帶清晰，無拖尾，所提到的RNA較完整，且^SrRNA亮度是18SrRNA的2倍，說明提取過程中沒有
10降解現象發生，而且在電泳檢測中看不到蛋白質和多糖污染，所提的RNA純凈；CTAB法提取的榛子雄花芽總RNA，條帶也比較清晰，但是^SrRNA亮度與18SrRNA相當，說明^SrRNA降解明顯，條帶有拖尾現象，DNA污染嚴重，有蛋白質、多糖等雜質污染，產量也較少；改良SDS 法提取的榛子雄花芽總RNA，不完整，28SrRNA降解明顯，條帶有拖尾，DNA、蛋白質、多糖等雜質污染嚴重。2、榛子雄花芽總RNA濃度和純度的檢測上述步驟1以瓊脂糖凝膠IXTBE電泳檢測榛子雄花芽總RNA完整性，其結果表明改良CTAB法提取榛子雄花芽總RNA樣品的效果相對比較好。以下為利用分光光度計檢測上述步驟一改良CTAB法和改良SDS法各自提取的榛子雄花芽總RNA樣品的OD值，進一步比較這兩種方法提取的產率和質量。結果如表1所示，改良CTAB法和改良SDS法所提取的雄花芽的0擬60/280分別為 2. 01和1. 08，這說明，相比改良SDS法，改良CTAB法所提取的RNA純度較高，DNA、蛋白質和多糖污染少。同時，在RNA產率上看，改良CTAB法(每克榛子雄花芽提取199. 53yg總 RNA)遠比改良SDS法(每克榛子雄花芽提取60. Olyg總RNA)高。本實施例的結果表明，綜合上述三種方法，改良CTAB法、CTAB法和改良SDS法都能從榛子雄花芽中提取到總RNA，相比較而言，改良CTAB法所提的總RNA較完整，條帶清晰， 得到了較高質量的RNA ；同時改良CTAB法所提取的總RNA樣品的產率也較高(每克榛子雄花芽提取199. 53 μ g總RNA)，這說明本發明所提供的改良CTAB法適合于榛子雄花芽總RNA 的提取。實施例3、從榛子成熟葉片提取總RNA樣品及其鑒定一、榛子成熟葉片總RNA樣品的提取試驗地設在位于北京市西郊鶩峰林場實驗基地。2010年8月，采集平歐雜交榛達維(育種代號84-2M)(張宇和，柳鎏，等.中國果樹志板栗榛子卷[M].北京中國林業出版社· 2005 :1-248.)的成熟葉片。下面將詳述如何利用改良CTAB法從榛子成熟葉片提取較高質量的總RNA樣品，具體操作步驟如下1)采樣采集榛子(平歐雜交榛達維，育種代號84-254)的成熟葉片，將其經液氮速凍后立即置于-80°C冰箱中保存(抑制內源RNase的活性)，得到樣品1 ；2)向50ml無菌離心管中加入IOml改良CTAB提取液，于65°C水浴鍋中預熱約 IOmin ；3)取約0. 2g步驟1)制備的樣品1，置于預冷的研缽中，加入少量聚乙聚烯吡咯烷酮(PVP)和維生素C (PVP和維生素C各0. Olg)，用液氮充分研磨成粉，得到樣品2;4)迅速將步驟3)研好的粉末(樣品2)倒入步驟2)預熱的改良CTAB提取液中， 65°C水浴lOmin，期間振蕩1次，使其混勻，得到樣品混合液3 ；5)向步驟4)得到的樣品混合液3中加入等體積的氯仿與異戊醇的體積比為 24 1的氯仿/異戊醇，混勻，于4°C 12000r/min離心lOmin，回收上清液；6)向步驟幻得到的上清液中加入等體積氯仿異戊醇(氯仿/異戊醇的體積比為 24 1)，混勻，于40C 12000r/min離心IOmin,回收上清液；7)向步驟6)得到的上清液中加入1/4體積的IOM的LiCl，混勻后于4°C放置過夜，于4°C 12000r/min離心30min，得到RNA沉淀；8)將步驟7)所得的RNA沉淀用預冷的75%乙醇清洗，得到總RNA的粗提物；9)將步驟8)得到的總RNA的粗提物用SSTE緩沖液(如果用的是1. 2ml的離心管，加500ul即可；一般是加所用離心管的2/5體積即可)溶解，加入等體積的氯仿與異戊醇的體積比為M 1的氯仿/異戊醇混勻，于4°C 12000r/min離心lOmin，回收上清液；10)向步驟9)得到的上清液中加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，于_20°C放置 2h,于 4°C 12000r/min 離心 30min，得到 RNA 沉淀；11)將步驟10)得到的RNA沉淀用預冷的75%乙醇洗兩次，再用預冷的無水乙醇洗一次，自然干燥5min(時間不宜太長，否則RNA不易溶解)，溶于100 μ 1 DEPC水，混勻， 于-80°C保存備用(可長期保存于2倍無水乙醇中)，獲得較純的總RNA樣品。同時以CTAB法和改良SDS法作為對照(具體方法同實施例1)。二、榛子成熟葉片總RNA樣品的鑒定利用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA提取好壞，主要依據^SrRNA與18SrRNA電泳譜帶的特征。如果帶型清晰且亮，28SrRNA亮度高于18SrRNA，且約是18SrRNA的2倍，則表明所提取到的總RNA量大、質量高、未降解。利用分光光度計檢測所提取的總RNA樣品的濃度和純度，若O擬60/280在1. 8-2. O之間，說明所提的總RNA較純，無其他雜質的污染。1、榛子成熟葉片總RNA完整性的檢測取1 μ 1上述步驟一提取的總RNA樣品，進行瓊脂糖凝膠IXTBE電泳檢測。由圖3所示，本發明所提供的改良CTAB法提取的榛子成熟葉片總RNA樣品，點樣孔干凈，條帶清晰，無拖尾，所提到的RNA較完整，且^SrRNA亮度是18SrRNA的2倍，說明提取過程中沒有降解現象發生，而且在電泳檢測中看不到蛋白質和多糖污染，所提的RNA純凈。而CTAB法提取的榛子成熟葉片總RNA，條帶也比較清晰，28SrRNA亮度與18SrRNA相當，說明^SrRNA 降解明顯，條帶有拖尾現象，DNA污染嚴重，有蛋白質、多糖等雜質污染，產量也較少；改良 SDS法提取的榛子成熟葉片總RNA，不完整，28SrRNA降解明顯，條帶有拖尾，DNA、蛋白質、多糖等雜質污染嚴重。2、榛子成熟葉片總RNA濃度和純度的檢測上述步驟1以瓊脂糖凝膠IXTBE電泳檢測榛子成熟葉片總RNA完整性，其結果表明改良CTAB法提取榛子成熟葉片總RNA樣品的效果比較好。以下為利用分光光度計 (紫外/可見分光光度計)檢測上述步驟一改良CTAB法和改良SDS法各自提取的榛子成熟葉片總RNA樣品的OD值，進一步比較這兩種方法提取的產率和質量。結果如表1所示，改良CTAB法和改良SDS法所提取的成熟葉片的O擬60/280分別為2. 02和1.68，這說明改良CTAB法所提取的RNA純度較高，DNA、蛋白質和多糖污染少。同時，在RNA產率上看，改良CTAB法(每克榛子成熟葉片提取116. 005 μ g總RNA)遠比改良 SDS法(每克榛子成熟葉片提取94. 525 μ g總RNA)高。本實施例的結果表明，綜合上述三種方法，改良CTAB法、CTAB法和改良SDS法都能從榛子成熟葉片中提取到總RNA，相比較而言，改良CTAB法所提的總RNA較完整，條帶清晰，得到了較高質量的RNA ；同時改良CTAB法所提取的總RNA樣品的產率也較高(每克榛子成熟葉片提取116. 005 μ g總RNA)，這說明本發明所提供的改良CTAB法適合于榛子成熟葉片總RNA的提取。
表1兩種提取方法提取榛子總RNA紫外吸收結果
權利要求
1.從植物組織中提取總RNA的方法，包括如下步驟1)將植物組織與聚乙烯吡咯烷酮和維生素C混合后，再加入液氮研磨成粉末；所述植物組織、所述聚乙烯吡咯烷酮和所述維生素C的配比為0.2g O.Olg O.Olg；2)將步驟1)得到的粉末加入到55-65°C的權利要求6所述提取液中，55-65°C保溫 lOmin，得到樣品混合液；3)對步驟2、得到的樣品混合液進行RNA的抽提和RNA的沉淀，得到總RNA；所述抽提為用氯仿/異戊醇進行的抽提；所述氯仿/異戊醇是由氯仿與異戊醇按照M 1的體積比混合得到的混合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述氯仿/異戊醇在抽提體系中體積百分含量為50%。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中所述RNA的沉淀包括用LiCl對所述RNA進行沉淀的步驟；所述LiCl在沉淀體系中的終濃度為2M。
4.根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于步驟幻中所述RNA的沉淀還包括用無水乙醇對所述RNA進行沉淀的步驟。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述RNA的抽提和所述RNA的沉淀包括如下步驟a)向所述樣品混合液中加入等體積的所述氯仿/異戊醇，混勻，于4°C12000r/min離心lOmin，回收上清液；b)向步驟a)得到的上清液中加入等體積的所述氯仿/異戊醇，混勻，于4°C，12000r/ min離心IOmin,回收上清液；c)向步驟b)得到的上清液中加入LiCl，使其終濃度為2M，混勻后于4°C放置過夜，于 40C 12000r/min 離心 30min，得到 RNA 沉淀；d)將步驟c)所得的RNA沉淀用75%乙醇清洗，得到總RNA的粗提物；e)將步驟d)得到的總RNA的粗提物用SSTE緩沖液溶解，加入等體積的所述氯仿/異戊醇，混勻，于4°C，12000r/min離心lOmin,回收上清液；f)向步驟e)得到的上清液中加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，于-20°C放置池，于 40C，12000r/min 離心 30min，得到 RNA 沉淀；g)將步驟f)得到的RNA沉淀用75%乙醇洗兩次，再用無水乙醇洗一次，自然干燥，溶于100 μ 1 DEPC水，得到所述總RNA0
6.從植物組織中提取總RNA的提取液，其特征在于所述提取液的溶劑為水，溶質為十六烷基三甲基溴化銨、Tris-Cl、乙二胺四乙酸、三鹽酸亞精胺、聚乙烯吡咯烷酮、氯化鈉、 β -巰基乙醇；所述十六烷基三甲基溴化銨在所述提取液中的含量為每100ml所述提取液中含有3g所述十六烷基三甲基溴化銨，所述Tris-Cl的終濃度為IOOmM,所述乙二胺四乙酸的終濃度為25mM，所述三鹽酸亞精胺在所述提取液中的含量為每100ml所述提取液中含有0. 05g所述三鹽酸亞精胺，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述提取液中的含量為每100ml所述提取液中含有3g所述聚乙烯吡咯烷酮，所述氯化鈉的終濃度為2M，所述β-巰基乙醇的終濃度為體積百分含量5%。
7.根據權利要求1-5中任一所述的方法，或權利要求6所述提取液，其特征在于所述植物組織為榛子組織。
8.根據權利要求7所述方法或所述提取液，其特征在于所述植物組織為榛子的幼葉、 雄花芽或成熟葉片。
全文摘要
本發明公開了一種從植物組織中提取總RNA的方法。本發明所提供的方法包括如下步驟1)將植物組織與PVP和維生素C混合后，再加入液氮研磨成粉末；所述植物組織、所述PVP和所述維生素C的配比為0.2g∶0.01g∶0.01g；2)將步驟1)得到的粉末加入到55-65℃的提取液中，55-65℃保溫10min，得到樣品混合液；3)對步驟2)得到的樣品混合液進行RNA的抽提和RNA的沉淀，得到總RNA；所述抽提為用氯仿/異戊醇進行的抽提。所述提取液含有3％的CTAB、100mM的Tris-c1(pH8.0)、25mM的EDTA(pH8.0)、2M的NaCl、5％的β-巰基乙醇、3％的PVP、0.05％的三鹽酸亞精胺等。實驗證明，本發明所提供的方法能夠從植物組織，如榛子的幼葉、雄花芽或成熟葉片中提取得到高質量的總RNA。
文檔編號C12N15/10GK102424825SQ20121000300
公開日2012年4月25日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者侯智霞, 孟曉慶, 張蘭, 蘇淑釵 申請人:北京林業大學