專利名稱：一種培養基發酵高產銀耳多糖的方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵培養技術領域，涉及ー種培養基發酵高產銀耳多糖的方法。
背景技術：
銀耳又稱白木耳，是ー種高等真菌，是世界上公認的重要藥材。銀耳中含有的ー種酸性多糖類物質，能提高機體的免疫功能，具有抗病毒的作用，促進T細胞的活動能力，故能有效地防治癌癥在內的多種疾病。銀耳多糖還能提高機體對原子輻射的防護能力，降低機體脂褐質沉積的物質，具有抗衰延年的作用等。目前市面上要大量獲得銀耳多糖主要采用對分生孢子進行液體深層發酵，發酵生產成本低廉，高產多糖，能實現產業化，能夠給生產企業取得顯著的經濟效益。高產銀耳多糖的研究大多數集中在對發酵條件進行優化，發酵培養基的優化在微生物產業化生產中舉足輕重，是從實驗室到エ業生產的必要環節。能否設計出ー個好的發酵培養基，是ー個發酵產品エ業化成功中非常重要的一歩。本發明是銀耳多糖液體深層發酵培養基優化，通過大量的實驗研究篩選，找到了一種最適合其生長酵母狀分生孢子菌發酵的培養基，目前市面上產多糖4 g/L左右，本發明的方法產多糖高達9. 5 g/L，在原來的基礎上提高發酵多糖的產量，以期達到生產最高發酵多糖的目的。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種培養基液體深層發酵高產銀耳多糖的方法，其特點是在生產中供菌種生長繁殖和積累發酵產物，保持銀耳多糖菌體良好的細胞形態，高密度的生長，獲得大量高純的銀耳多糖產物。本發明的技術方案如下
一種培養基發酵高產銀耳多糖的方法，其特征在于按如下的步驟進行
(1)菌種
銀耳芽孢Tremella fuciformis CGMCCC5. 466購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
(2)培養基配制
銀耳芽孢甘油保藏培養基甘油300g/L ；
銀耳芽孢斜面保藏培養基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸鎂0. 3g/L, 磷酸ニ氫鉀2g/L，瓊脂20g/L ；
銀耳芽孢種子培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸鎂2.5 g/L，YNB(無氨基酵母氮源)1. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；
銀耳芽孢發酵培養基葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2.5 g/L, YNB(無氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；(3)制備エ藝
菌種保藏用甘油保藏培養基，-70°C保存一年；
種子搖瓶培養接種量以5 10%菌液接入到種子培養基中培養1天，培養溫度25°C ； 發酵培養將培養好的種子以8 10%接種量接入到發酵罐中，發酵裝液量5L，發酵溫度25°C，攪拌轉速200rpm，用氨水控制PH6. 0 ；發酵時間到48h，調攪拌轉速到300rpm，發酵培養周期到72h結束，離心收集上清液，濃縮，醇沉得到銀耳多糖。本發明更加詳細的方法如下
(1) 菌種Tremella fuciformis CGMCCC5. 466購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。(2) 培養基配制
銀耳芽孢甘油保藏培養基甘油300g/L。銀耳芽孢斜面保藏培養基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸鎂0. 3g/ L,磷酸ニ氫鉀2g/L，瓊脂20g/L。銀耳芽孢種子培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸鎂2.5 g/L，YNB(無氨基酵母氮源)1.5g/L，磷酸ニ氫鉀0.5g/L，PH要求6.0。銀耳芽孢發酵培養基葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2. 5 g/L, YNB (無氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6.0。(3) 制備エ藝
菌種保藏用甘油保藏培養基，-70°C保存一年。種子搖瓶培養接種量以5 10%菌液接入到種子培養基中培養1天，培養溫度 25 0C ο發酵培養將培養好的種子以10%接種量接入到發酵罐中，發酵裝液量5L，發酵溫度25°C，攪拌轉速200rpm，用氨水控制PH6. 0 ；發酵時間到48h，調攪拌轉速到300rpm，發酵培養周期到7 結束，離心收集上清，濃縮，醇沉多糖。發酵培養基為(葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，YNB (無氨基酵母氮源)2g/L，PH要求6. 0)。本發明制備的發酵多糖的理化特性如下
方法先采用脫蛋白(Sevage法)、脫小分子(透析)、凝膠色譜純化(EDAE柱)，柱純化吋，采用硫酸苯酚法監測，然后進行DEAE柱色譜圖分析得到兩種均一體多糖BN516和 BN608。BN516和BN608均一體多糖的生物活性抑制淋巴瘤實驗
取BN516和BN608多糖，用注射用水配置成濃度5mg/kg、10mg/kg。IRM-2純系小鼠，雌雄各半。在IRM-2純系小鼠左側腹股溝處皮下注射，把IRM-2純系小鼠自發淋巴瘤傳代培養，處死IRM-2純系小鼠剝離瘤塊，稱瘤重，通過實驗表明，銀耳多糖對淋巴瘤具有抑制作用。本發明的有益效果通過發酵培養中設計到的培養基，使發酵過程中有利分生孢子菌體的生長，代謝大量的目標產物，得到了高效生產多糖9. 5g/L，有利于縮短了發酵周期、成本低廉、エ藝簡單易操作、環境污染小、能得到高產的多糖及容易實現產業化。
具體實施方式
下面結合實施例說明本發明，這里所述實施例的方案，不限制本發明，本領域的專業人員按照本發明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發明的范圍內，本發明的范圍和實質由權利要求來限定。其中所用的培養基個各種試劑均有市
隹實施例1
本發明用的菌種為iTremella fuciformis CGMCCC5. 466購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。先把菌種轉接到銀耳芽孢斜面保藏培養基中培養4天，溫度要求 25°C，斜面保藏培養基為(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸鎂0.3g/L，磷酸 ニ氫鉀2g/L，瓊脂20g/L);然后把培養好的斜面菌種轉接到甘油保藏培養基中進行-70°C 保存，保存時間為一年，甘油保藏培養基為(甘油300g/L)；
在甘油保藏培養好的菌種以10%接種量轉接到搖瓶種子培養基中培養1天，培養溫度25°C，搖床轉速160rpm，種子培養基為(葡萄糖20g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2. 5g/L， YNB(無氨基酵母氮源)1.5 g/L，磷酸ニ氫鉀0.5g/L，PH要求6.0);將培養好的種子以10% 接種量接入到發酵罐中，發酵裝液量5L，發酵溫度25°C，攪拌轉速200rpm，根據細胞的生長情況把溶氧控制在50%，通氣速率3vvm，用氨水控制PH6. 0 ；當發酵時間到4 進行調攪拌轉速到300rpm，發酵培養周期到7 結束，發酵培養基為(葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2. 5g/L，磷酸ニ氫鉀2. 5g/L，YNB (無氨基酵母氮源)2g/L，PH要求6. 0)；
把發酵液進行離心收集細胞和上清液，離心轉速為3000 rpm,時間為20min ；將收集好的發酵上清進行旋轉蒸發儀濃縮，濃縮溫度75°C ；加三倍體積乙醇進行多糖沉淀，靜置 IOmin后離心收集沉淀，離心轉速為3000 rpm，時間為20min，沉淀用少許乙醚洗進行脫色， 用溫箱50°C烘干，收集得到高產多糖9. 5g/L。實施例2
(1)菌種銀耳芽抱！1remella fuciformis CGMCCC5. 466購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
(2)培養基配制
銀耳芽孢甘油保藏培養基甘油300g/L ；
銀耳芽孢斜面保藏培養基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸鎂0. 3g/L, 磷酸ニ氫鉀2g/L，瓊脂20g/L ；
銀耳芽孢種子培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸鎂2.5 g/L，YNB(無氨基酵母氮源)1. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；
銀耳芽孢發酵培養基葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2.5 g/L, YNB(無氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氫鉀0.5g/L，PH要求6.0 ；
(3)制備エ藝
菌種保藏用甘油保藏培養基，-70°C保存一年；
種子搖瓶培養接種量以5%菌液接入到種子培養基中培養1天，培養溫度25°C ； 發酵培養將培養好的種子以10%接種量接入到發酵罐中，發酵裝液量5L，發酵溫度 25°C，攪拌轉速200rpm，溶氧控制50%，用氨水控制PH6. 0 ；發酵時間到48h，調攪拌轉速到 300rpm，發酵培養周期到7 結束，把發酵液進行離心收集細胞和上清液，離心轉速為3000 rpm，時間為20min ；將收集好的發酵上清進行旋轉蒸發儀濃縮，濃縮溫度75°C ；加三倍體積乙醇進行多糖沉淀，靜置IOmin后離心收集沉淀，離心轉速為3000 rpm,時間為20min，沉淀用少許乙醚洗進行脫色，用溫箱50°C烘干，收集得到高產多糖9. 5g/L。實施例3比較試驗常規方法
(1)方法液體深層發酵
(2)步驟先用種子培養基培養種子，種子培養基為麥芽糖10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨4g/L，磷酸ニ氫鉀0. 46g/L，磷酸氫ニ鉀lg/L，硫酸鎂lg/L，PH自然；培養好的種子在轉接到發酵培養基中培養，發酵培養基為麥芽糖10g/L，葡萄糖20g/L，豆粕20g/L，磷酸ニ氫鉀0. 46g/L，磷酸氫ニ鉀lg/L，硫酸鎂lg/L，PH自然；培養120h收集發酵液進行濃縮，醇沉， 收集多糖。(3)結果收集得到多糖4 g/L左右。本發明的方法
(1)方法液體深層發酵
(2)步驟先用種子培養基培養種子，種子培養基為葡萄糖20g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2. 5 g/L, YNB (無氨基酵母氮源)1. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；培養好的種子在轉接到發酵培養基中培養，發酵培養基為葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2.5 g/ L, YNB (無氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；培養7 收集發酵液進行濃縮，醇沉，收集多糖。(3)結果收集得到高產多糖9. 5 g/L。
權利要求
1. 一種培養基發酵高產銀耳多糖的方法，其特征在于按如下的步驟進行(1)菌種銀耳芽孢Tremella fuciformis CGMCCC5. 466購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；(2)培養基配制銀耳芽孢甘油保藏培養基甘油300g/L ；銀耳芽孢斜面保藏培養基土豆200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸鎂0. 3g/L, 磷酸ニ氫鉀2g/L，瓊脂20g/L ；銀耳芽孢種子培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸鎂2.5 g/L，YNB(無氨基酵母氮源)1. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，PH要求6. 0 ；銀耳芽孢發酵培養基葡萄糖30g/L，蛋白胨8g/L，硫酸鎂2.5 g/L, YNB(無氨基酵母氮源)2g/L，磷酸ニ氫鉀0.5g/L，PH要求6.0 ；(3)制備エ藝菌種保藏用甘油保藏培養基，-70°C保存一年；種子搖瓶培養接種量以5 10%菌液接入到種子培養基中培養1天，培養溫度25°C ；發酵培養將培養好的種子以8 10%接種量接入到發酵罐中，發酵裝液量5L，發酵溫度25°C，攪拌轉速200rpm，用氨水控制PH6. 0 ；發酵時間到48h，調攪拌轉速到300rpm，發酵培養周期到72h結束，離心收集上清液，濃縮，醇沉得到銀耳多糖。
全文摘要
本發明涉及一種培養基發酵高產銀耳多糖的方法，屬于微生物發酵培養技術領域。本發明用于Tremellafuciformis CGMCCC5.466作為菌種，先接入種子培養基中培養一天，將培養好的種子接入到發酵培養基中培養，發酵裝液量5L,發酵周期72h，然后把發酵液進行離心，收集，濃縮，醇沉，乙醚洗，烘干，得到高產多糖9.5g/L，本發明的方法有效的縮短了發酵周期、具有工藝簡單易操作、環境污染小、能得到高產的多糖及容易實現產業化的特點。
文檔編號C12R1/645GK102559802SQ20121000409
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者孫長海, 李建, 楊珺, 王昌華, 王玉香, 童應凱, 黃海東 申請人:天津超然生物技術有限公司