專利名稱：一種增強型熒光定量pcr方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種檢測轉基因植物及其產品的增強型熒光定量PCR方法。
背景技術：
隨著生命科技的不斷進步，人類改變了植物常規育種的方法，通過基因工程的手段，將外源基因轉入植物體內，從而培育出一批高產、抗逆性性強的轉基因植物品種。自90 年代起到2010年，全世界轉基因植物的種植面積累計達10億公頃。轉基因作物已成規模。 盡管如此，世界各國對轉基植物的態度仍很謹慎，并出臺了很多的政策法規，要求對轉基因成分進行檢測，并要求檢測結果為陽性者需要標識。目前，常用的檢測方法有實時熒光PCR，普通凝膠PCR等檢測方法。實時熒光 PCR(RT-PCR):是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR 進程，最后通過檢測到的熒光信號對未知模板進行分析的方法。然而這些檢測方法都存在自身的不足，如對某些深加工產品及轉基因含量較低的產品存在判定盲區，即無法對檢測結果進行一次性判定。這就需要開發高效、準確、更靈敏的轉基因檢測方法。這對于國家的進出口貿易、 轉基因安全性以及對于海關、商檢、出入境檢驗檢疫部門、食品加工部門來說都是至關緊要需要解決的一個問題。

發明內容
本發明針對現有技術無法檢測的轉基因植物DNA分子含量較低的樣品或因深加工轉基因產品造成DNA分子的嚴重破壞的樣品以及應用熒光定量PCR檢測方法無法判定陰性陽性的灰區的樣品，提供一種增強型熒光定量PCR方法，其靈敏度、準確度更高，可廣泛應用于轉基因植物及其加工產品的檢測。本發明提供的一種檢測轉基因玉米品系BTll的增強型熒光定量PCR方法，將包含引物組0. 5 μ Μ、探針0. 5 μ Μ、模板1 IOOng的總體積25 μ 1的反應體系進行實時熒光定量PCR反應，反應條件為50°C，2min;95 °C IOmin ；95°C 15s，45°C 30s，72°C 30s，10 個循環；95°C 15s,60°C Imin0作為優選，檢測目的基因為BTll結構特異基因crylAb與adhl-IVS6的邊界序列， 所述引物組中上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示。更優選地，所述探針序列如SEQ ID No. 3所示。所述探針可以利用本領域已知各種核酸標記方法使探針分子標記信標分子，所述方法包括但不限于，PCR、RT-PCR、體外轉錄、 隨機引物標記、缺口平移以及末端轉移標記等方法。所述信標分子可以為選擇合適熒光素；
3所述熒光素包括但不限于，Cy3, Cy5、異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅等。本發明還提供一種檢測轉基因水稻品系TT51-1的增強型熒光定量PCR方法，將包含引物組0. 5 μ Μ、探針0. 25 μ Μ、模板1 IOOng的總體積25 μ 1的反應體系進行實時熒光定量PCR反應，反應條件為50°C,2min ；95 "C IOmin95"C 15s，45°C 30s，72°C 30s，10 個循環；95°C 15s,60°C Imin0作為優選，檢測目的基因為TT51外源基因cryIAb，所述引物組中上游引物序列如 SEQ ID No. 4所示，下游引物序列如SEQ ID No. 5所示。更優選地，所述探針序列如SEQ ID No. 6所示。本發明針對轉基因玉米品系BT11、轉基因水稻品系TT51-1篩選出適合的引物及探針，且對整個檢測系統進行了優化，包括引物探針濃度與配比的優化，通過選用不同引物濃度，及在相同引物濃度下不同的引物、探針濃度比得出結論在相同引物及探針濃度比情況下，引物及探針濃度越高，實時PCR曲線的Afo1值也就相對越高，同時Ct值也呈現相應變化。當引物與探針的比例在2 1的時候擴增曲線形狀較好，重復性好，Ct值更小。而改變退火溫度對Ct值和熒光值影響不大。而中間的循環數越多，則Ct值越小而對熒光值影響不大。通過對標準品進行梯度稀釋，ERT-PCR內源基因和外源基因的擴增效率都達到要求，并且線性關系好，R2 > 0. 98。擴增效率在100%左右，說明ERT-PCR反應條件已達到優化。通過ERT-PCR和RT-PCR比較發現，RT-PCR具有檢測方法靈敏度高，其檢測下限較普通RT-PCR高出10倍左右。ERT-PCR與RT-PCR采用相同的模板，ERT-PCR的Ct值范圍在 12-30，而普通RT-PCR的Ct值范圍則位于22-39之間，而一般認為Ct值在40左右就很難判定陰性或者陽性，從這個角度上分析，ERT-PCR提高了檢測的靈敏度。另外，我們分別采用 ERT-PCR以及RT-PCR分別對轉基因種子(0. 5%，1 %，5% )進行定量定值結果符合要求，顯示ERT-PCR檢測結果比RT-PCR更接近真實值，說明ERT-PCR的準確性要比RT-PCR高。綜上，與目前轉基因檢測普遍使用的熒光定量PCR檢測技術相比，本發明所述 ERT-PCR具有檢測方法靈敏度高，約為RT-PCR靈敏度的10倍。針對轉基因含量較低或深加工的轉基因產品造成的DNA分子的嚴重破壞，提取樣品中含有大量PCR抑制劑以及由于目前所應用的熒光定量PCR檢測方法無法判定陰性陽性的灰區的樣品特別適合，并可在多種轉基因品系的檢測中應用，具有廣泛的應用前景。定義和一般術語本發明將會把確定的具體化的內容詳細列出。所屬領域的技術人員將識別許多類似或等同于在此所描述的方法和物質，這些可以應用于本發明的實踐中去。本發明絕非限于方法和物質的描述。增強型熒光定量PCR(ERT-PCR)對熒光定量PCR方法進行了改進，改進方面包括 退火溫度、循環數等，而大大提高熒光定量PCR檢測靈敏度和準確性的一種檢測方法。實時熒光PCR(RT-PCR)實時熒光PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過檢測到的熒光信號對未知模板進行分析的方法。灰區當熒光定量PCR的CT值位于35-40之間將無法判定陰性及陽性，此區間稱為灰區。
具體實施例方式本發明公開了一種檢測轉基因植物及其產品的增強型熒光定量PCR方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。實驗中所用試劑耗材材料陽性轉基因玉米種子BT11，陽性轉基因水稻種子TT51-1，以上樣品由香港海康生命科技有限公司提供。IRMM購買的NK603標準品(分別為0. 1 %、0. 5%、1 %、2%、 5% )轉基因植物及深加工產品提取方法(In house)，購自?？瞪萍加邢薰?； Taqman基因表達預混液(Master mix)，購自ABI公司。實施例1 針對BT11的ERT-PCR條件優化-探針、引物濃度優化材料=BTllGenome ；BT11SSIIB 引物 F, R(10 μ Μ)，SSIIB 探針(10 μ Μ) ；Specific 引物 F，R(10 μ Μ)，Specific 探針(10 μ Μ)；試劑ABI2 XMaster Mix，ddH20儀器:ABI7500檢測目的基因為BT11結構特異基因crylAb與adhl_IVS6的邊界序列。引物探
針序列如下
權利要求
1.一種檢測轉基因玉米品系BTll的增強型熒光定量PCR方法，其特征在于，將包含引物組0. 5 μ Μ、探針0. 5 μ Μ、模板I-IOOng的總體積25 μ 1的反應體系進行實時熒光定量PCR 反應，反應條件為50°C,2min ；95 0C IOmin ；950C 15s，45°C 30s, 72°C 30s，10 個循環；95°C 15s，60°C lmin，40 個循環。
2.根據權利要求1所述的增強型熒光定量PCR方法，其特征在于，所述引物組中上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示。
3.根據權利要求1或2所述的增強型熒光定量PCR方法，其特征在于，所述探針序列如 SEQ ID No. 3 所示。
4.一種檢測轉基因水稻品系TT51-1的增強型熒光定量PCR方法，其特征在于，將包含引物組0. 5 μ M、探針0. 25 μ Μ、模板IOOng的總體積25 μ 1的反應體系進行實時熒光定量 PCR反應，反應條件為50°C,2min ；95 0C IOmin950C 15s，45°C 30s, 72°C 30s，10 個循環；95°C 15s，60°C lmin，40 個循環。
5.根據權利要求4所述的增強型熒光定量PCR方法，其特征在于，所述引物組中上游引物序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物序列如SEQ ID No. 5所示。
6.根據權利要求4或5所述的增強型熒光定量PCR方法，其特征在于，所述探針序列如 SEQ ID No. 6 所示。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，公開了一種檢測轉基因植物及其產品的增強型熒光定量PCR方法。本發明所述方法靈敏度高，特異性強，操作簡單，樣本范圍廣，尤其適用于轉基因植物的定量檢測及定性檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102424863SQ20121000410
公開日2012年4月25日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者于常海, 劉樂庭, 楊濱 申請人:北京大學, ?？瞪锟萍?北京)有限公司