專利名稱：大腸癌早期相關dna檢測方法、相關檢測探針組合物及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及疾病相關DNA檢測技術領域，更具體地，涉及大腸癌早期相關DNA檢測方法技術領域，特別是指一種大腸癌早期相關DNA檢測方法、相關檢測探針組合物及檢測試劑盒。
背景技術：
結腸癌是發生于結腸部位的常見的消化道惡性腫瘤。據世界流行病學調查，結腸癌在歐美人群中發病率很高，居內臟種瘤第二位。隨著我國人民生活水平的提高，飲食結構的改變，其發病率在國內也呈逐年上各趨勢。目前的結腸癌診斷技術有X線檢查，纖維結腸鏡檢查，CT檢查等可視化物理診斷方法和潛血試驗，血清癌胚抗原測定，血紅蛋白測定，組織病理學檢查等生化技術。可視化物理診斷方法往往到癌癥發展后期才能檢出，并對檢測人員的技術，經驗要求較高。 血清癌胚抗原對結腸癌的診斷陽性率不高(50% -60% )，尤其對早期腸癌的敏感性很差 (10% -20% )，故無法將它用于無癥狀人群的結腸癌篩選。組織病理學檢查等是侵入性檢查，具有不同程度的風險性。熒光定量PCR是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，能實時監控反應過程，并結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品的初始模板量的PCR技術。循環DNA是指存在于血漿或血清中的游離DNA。腫瘤細胞在增殖，轉移和凋亡中都會不斷的釋放DNA進入血液循環中，因此癌癥相關循環血DNA是監測腫瘤的生理和病理變化，細胞代謝分化的重要指標。因此，如果能夠采用循環血DNA PCR定量技術對大腸癌早期相關DNA進行檢測，則循環血DNA PCR定量技術檢測相對目前主流的結腸癌診斷技術來說，具有快速、準確、直觀的特點。

發明內容
本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種大腸癌早期相關 DNA檢測方法、相關檢測探針組合物及檢測試劑盒，該檢測方法設計巧妙，相對傳統大腸癌檢測技術具有發現早，靈敏度高，周期短等顯著優點，檢測結果準確可靠，從而可作為醫師治療和用藥的參考依據，適于大規模推廣應用。為了實現上述目的，在本發明的第一方面，提供了一種大腸癌早期相關DNA檢測方法，其特點是，包括步驟a.提取血漿或血清樣品的循環DNA ;b.將所述循環DNA進行甲基化修飾；c.采用PCR弓丨物對和TaqMan MGB熒光探針對所述步驟b得到的循環DNA進行熒光定量PCR，其中所述PCR引物對是SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；d.根據所述熒光定量PCR中收集的熒光信號而形成的實時擴增曲線，分析所述循環DNA中是否存在大腸癌早期相關DNA。較佳地，在所述步驟b中，采用重亞硫酸鹽對所述循環DNA進行甲基化修飾。在本發明的第二方面，提供了一種大腸癌早期相關DNA檢測探針組合物，其特點是，包括PCR引物對和TaqMan MGB熒光探針，其中所述PCR引物對是SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO 3 所示的核苷酸序列。在本發明的第三方面，提供了一種大腸癌早期相關DNA檢測試劑盒，其特點是，包括引物容器和熒光探針容器，所述引物容器內具有PCR引物對干燥粉末或溶液，所述熒光探針容器內具有TaqMan MGB熒光探針干燥粉末或溶液，其中所述PCR引物對是SEQ ID NO: I和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。本發明的創新點在于通過熒光定量PCR技術檢測人體血漿或血清中是否存在大腸癌早期相關DNA，設計巧妙，相對傳統大腸癌檢測技術具有發現早，靈敏度高，周期短等顯著優點，檢測結果準確可靠，從而可作為醫師治療和用藥的參考依據，適于大規模推廣應用。
具體實施例方式為更好的理解本發明的內容，下面結合具體實施例作進一步說明。I 試劑I. I 定量 PCR 探針定量PCR使用的引物探針(序列如下)溶解在TE緩沖液中，濃度5μΜ.-20 凍存。
權利要求
1.一種大腸癌早期相關DNA檢測方法，其特征在于，包括步驟a.提取血漿或血清樣品的循環DNA；b.將所述循環DNA進行甲基化修飾；c.采用PCR弓I物對和TaqManMGB熒光探針對所述步驟b得到的循環DNA進行熒光定量 PCR，其中所述PCR引物對是SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；d.根據所述熒光定量PCR中收集的熒光信號而形成的實時擴增曲線，分析所述循環 DNA中是否存在大腸癌早期相關DNA。
2.根據權利要求I所述的大腸癌早期相關DNA檢測方法，其特征在于，在所述步驟b 中，采用重亞硫酸鹽對所述循環DNA進行甲基化修飾。
3.一種大腸癌早期相關DNA檢測探針組合物，其特征在于，包括PCR引物對和TaqMan MGB熒光探針，其中所述PCR引物對是SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
4.一種大腸癌早期相關DNA檢測試劑盒，其特征在于，包括引物容器和熒光探針容器， 所述弓I物容器內具有PCR弓丨物對干燥粉末或溶液，所述熒光探針容器內具有TaqMan MGB熒光探針干燥粉末或溶液，其中所述PCR引物對是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及一種大腸癌早期相關DNA檢測方法，其特點是，包括步驟a、提取血漿或血清樣品的循環DNA；b、將循環DNA進行甲基化修飾；c、采用PCR引物對和TaqMan MGB熒光探針對步驟b得到的循環DNA進行熒光定量PCR，其中PCR引物對是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，TaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；d、根據熒光定量PCR中收集的熒光信號而形成的實時擴增曲線，分析循環DNA中是否存在大腸癌早期相關DNA。還涉及相關的檢測探針組合物和試劑盒。本發明的大腸癌早期相關DNA檢測方法設計巧妙，相對傳統大腸癌檢測技術具有發現早，靈敏度高，周期短等顯著優點，檢測結果準確可靠，從而可作為醫師治療和用藥的參考依據，適于大規模推廣應用。
文檔編號C12N15/11GK102586441SQ201210052819
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月2日 優先權日2011年3月18日
發明者趙翊均 申請人:趙翊均