專利名稱：肺腺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種肺腺癌易感基因檢測試劑盒，根據(jù)檢測結(jié)果從基因?qū)用嬖u(píng)估肺腺癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并作為預(yù)防和治療肺腺癌的方向指導(dǎo)。
背景技術(shù)：
肺腺癌在各類肺癌中約占20% -30%。肺腺癌大多數(shù)起源于較小的支氣管黏膜分泌粘液的上皮細(xì)胞，因此大多數(shù)腺癌位于肺的周圍部分，呈球形腫塊，靠近胸膜。女性病人較為多見，發(fā)病年齡亦較小。肺腺癌與吸煙無密切關(guān)系，一部分病例癌腫發(fā)生在肺纖維疤痕病變的基礎(chǔ)上。腺癌在早期一般沒有明顯的臨床癥狀，往往在胸部X線檢查時(shí)才發(fā)現(xiàn)，因此通過一定檢測手段篩查出易患肺腺癌的高危人群，指導(dǎo)這類人群提早預(yù)防肺腺癌的發(fā)生至關(guān)重要。研究表明，CYPlAl基因上Ile462Val及MSPI位點(diǎn)多態(tài)性，XRCCl基因上Arg399Gln 位點(diǎn)多態(tài)性，MTHFR基因上C677T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的6個(gè)單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性與肺腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，可以作為預(yù)測受檢者是否屬于易患肺腺癌高危人群的科學(xué)依據(jù)。CYPlAl基因編碼細(xì)胞色素P4501A1。該蛋白是重要的活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類。被激活的CYPlAl能夠?qū)⒍喾N環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)如多環(huán)芳烴轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒素或其他致癌物質(zhì)，從而早呢更加癌癥發(fā)生的危險(xiǎn)。分子生物學(xué)研究表明，CYPlAl第462號(hào)氨基酸由Ile變?yōu)閂al，以及CYP1A1MSPI位點(diǎn)T — C，會(huì)增加CYPlAl酶活性，可產(chǎn)生高誘導(dǎo)活性的CYPlAl酶，使多環(huán)芳烴類化合物活化速率加快，導(dǎo)致多種癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高。國內(nèi)外研究表明CYPlAl基因多態(tài)性與肺癌相關(guān)，大樣本的中國人群的關(guān)聯(lián)分析顯示，該位點(diǎn)的多態(tài)現(xiàn)象是中國人群中重要的肺癌遺傳易感因素之一。因此該位點(diǎn)可以作為肺癌易感性的遺傳檢測因子。XRCCl是人類X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因I。XRCCl基因編碼的蛋白對(duì)因電離輻射和烷基化物引起的DNA單鏈斷裂能起到有效的修復(fù)作用。XRCCl編碼的蛋白與DNA連接酶 III、聚合酶β、多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶交互作用，參與DNA的堿基切除通路。分子生物學(xué)研究表明，XRCCl基因上第399號(hào)氨基酸Arg-Gln的替代，可引起XRCCl活性降低，導(dǎo)致個(gè)體的 DNA修復(fù)能力下降。MTHFR基因編碼5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶。在葉酸代謝過程中是葉酸活化的核心酶，研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因上C677T多態(tài)性位點(diǎn)突變可以導(dǎo)致酶的熱穩(wěn)定性和酶活性的下降，從而引起DNA甲基化出現(xiàn)異常，這種甲基化異常可能導(dǎo)致癌基因和抑癌基因表達(dá)異常，影響對(duì)細(xì)胞生長和功能的調(diào)控，促進(jìn)癌癥的發(fā)生。GSTMl全稱Glutathione S-transferase Ml,中文名為谷胱;甘妝硫轉(zhuǎn)移酶Ml。該基因最為常見的變異為整個(gè)基因的缺失，該缺失型導(dǎo)致整個(gè)基因的功能喪失，與多種癌癥的發(fā)病相關(guān)，會(huì)大大提高癌癥的發(fā)病率。原因可能就是對(duì)環(huán)境毒物和致癌物質(zhì)的易感性提高導(dǎo)致的。分子生物學(xué)研究也表明，GSTTl缺失型的個(gè)體整個(gè)基因缺失并喪失功能，從而也相當(dāng)于增加了環(huán)境毒素和致癌物質(zhì)的濃度，提高了個(gè)體易患一系列類型癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，鑒于CYPlAl基因，XRCCl基因，MTHFR基因，GSTMl基因，GSTTl基因在肺腺癌變過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出受檢者在肺腺癌發(fā)生相關(guān)的基因單核苷酸位點(diǎn)基因型，及時(shí)篩查出易患肺腺癌的高危人群，從而有針對(duì)性的預(yù)防和治療肺腺癌，這對(duì)于降低肺腺癌的發(fā)病率有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
基于CYPlAl基因上Ile462Val及MSPI位點(diǎn)多態(tài)性，XRCCl基因上Arg399Gln位點(diǎn)多態(tài)性，MTHFR基因上C677T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型可作為評(píng)估肺腺癌發(fā)病的危險(xiǎn)因子的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種肺腺癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYPlAl基因上Ile462Val及MSPI位點(diǎn)多態(tài)性，XRCCl基因上Arg399Gln位點(diǎn)多態(tài)性，MTHFR基因上C677T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性弓I物對(duì)及DNA測序引物； PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)；PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應(yīng)體系10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(duì)(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產(chǎn)物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。測序反應(yīng)體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I.檢測試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對(duì)(I)CYPlAl (Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'(2)CYP1A1 (MspI)正向引物5' GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3'CYPlAl (MspI)反向引物5' AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3'(3)XRCCl(Arg399Gln)正向引物5' TGACCTTGCGGGACCTTAG3'XRCCl(Arg399Gln)反向引物5' CCAAGACCCTTTCACTCCTATC3'(4)MTHFR(C677T)正向引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(5)GSTM1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3;(6)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反應(yīng)條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環(huán)28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應(yīng)使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測序引物(I)CYPlAl (Ile462Val)測序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'(2) CYPlAl (MspI)測序引物5' GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3'(3)XRCCl(Arg399Gln)測序引物5' TGACCTTGCGGGACCTTAG3'(4)MTHFR(C677T)測序引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(5)GSTMl (Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'(6)GSTTl (Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物Iul，25% Bigdye mixlul,3. 2uMDNA 測序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。
5、基因型分析熟悉DNA測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.對(duì)人們進(jìn)行預(yù)防肺腺癌發(fā)病的基因無創(chuàng)檢測的服務(wù)I.采樣及抽提DNA由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用酚氯仿法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提2.基因型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)受檢者基因組DNA的CYPlAl基因上Ile462Val及 MSPI位點(diǎn)多態(tài)性，XRCCl基因上Arg399Gln位點(diǎn)多態(tài)性，MTHFR基因上C677T位點(diǎn)多態(tài)性， GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別進(jìn)行DNA測序，確定這6個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。3.肺腺癌發(fā)病高危人群風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估通過對(duì)受檢者SNPs基因型的分析，出具肺腺癌易感基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析報(bào)告單。 報(bào)告中詳細(xì)說明了受檢者CYPlAl基因上Ile462Val及MSPI位點(diǎn)多態(tài)性，XRCCl基因上 Arg399Gln位點(diǎn)多態(tài)性，MTHFR基因上C677T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTMl基因缺失與否(Present/ Null)位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的6個(gè)基因上SNP位點(diǎn)基因檢測信息以及遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。除此之外，根據(jù)受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明和解讀肺腺癌易感基因無創(chuàng)檢測報(bào)告單。
權(quán)利要求
1.一種檢測肺腺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于檢測CYPlAl基因上 Ile462Val及MSPI位點(diǎn)多態(tài)性，XRCCl基因上Arg399Gln位點(diǎn)多態(tài)性，MTHFR基因上C67H 位點(diǎn)多態(tài)性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否 (Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)CYPlAl 基因上Ile462Val及MSPI位點(diǎn)多態(tài)性，XRCCl基因上Arg399Gln位點(diǎn)多態(tài)性，MTHFR基因上 C677T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否 (Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這6個(gè)SNPs 位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對(duì)CYPlAl基因上Ile462Val及MSPI位點(diǎn)多態(tài)性，XRCCl基因上Arg399Gln位點(diǎn)多態(tài)性，MTHFR基因上 C677T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性，GSTTl基因缺失與否 (Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)而設(shè)計(jì),能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出上述6個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的6對(duì)特異性引物序列如下(1)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'(2)CYPlAl (MspI)正向引物5, GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3'CYPlAl (MspI)反向引物5' AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3'(3)XRCCl(Arg399Gln)正向引物5'TGACCTTGCGGGACCTTAG3'XRCCl (Arg399Gln)反向引物5' CCAAGACCCTTTCACTCCTATC3'(4)MTHFR (C677T)正向引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR (C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(5)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(6)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的6條DNA測序引物序列如下(1)CYPlAl(Ile462Val)測序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'(2)CYPlAl (MspI)測序引物5, GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3'(3)XRCCl(Arg399Gln)測序引物5'TGACCTTGCGGGACCTTAG3'(4)MTHFR(C677T)測序引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(5)GSTMl(Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'(6)GSTTl(Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1)卩0 反應(yīng)體系10\ 0 反應(yīng)緩沖液2.5111，251111 dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul，20uM特異性引物對(duì)，每條引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產(chǎn)物純化體系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應(yīng)體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測肺腺癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYP1A1基因上Ile462Val及MSPI位點(diǎn)多態(tài)性，XRCC1基因上Arg399Gln位點(diǎn)多態(tài)性，MTHFR基因上C677T位點(diǎn)多態(tài)性，GSTM1基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性，GSTT1基因缺失與否(Present/Null)位點(diǎn)多態(tài)性的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測與肺腺癌發(fā)生密切相關(guān)的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型來評(píng)估受檢者肺腺癌患病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并最終根據(jù)每一位受檢者的基因檢測結(jié)果從基因?qū)用嬷笇?dǎo)受檢者有針對(duì)性的預(yù)防肺腺癌的發(fā)生，降低肺腺癌的發(fā)病幾率。本發(fā)明采樣方法是口腔黏膜細(xì)胞采樣，無痛、無創(chuàng)、避免了交叉感染。測序檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，不必購置價(jià)格昂貴的進(jìn)口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586444SQ20121005361
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者姜麗, 潘加奎 申請(qǐng)人:解碼(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司