專利名稱：子宮內膜癌易感基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種子宮內膜癌易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估女性子宮內膜癌發病的風險級別，并作為針對性預防和治療的指導依據。
背景技術：
近年來，子宮內膜癌的發病率呈上升趨勢，成為繼乳腺癌和卵巢癌之后威脅女性健康的婦科腫瘤。多數流行病學研究顯示子宮內膜癌的危險因素都與雌激素有關，雌激素水平升高導致的內膜增生及DNA損傷被認為是子宮內膜癌發生的主要機制。已經有大量文獻報道，細胞色素P450酶(CYP1A1，CYP1B1，CYP17等)在雌激素的代謝過程中起重要作用。雌激素代謝過程中有兩條主要的競爭性代謝途徑生成代謝中間產物兒茶酚雌激素一條代謝生成低活性的2-羥基雌二醇Q-OH2)；另一條生成具有活性的4-羥基雌二醇 (4-0HE2)。CYPlAl是人體肝外將雌激素進行2-羥基化代謝的主要I相代謝酶之一。另外， CYPlAl還具有芳香烴羥基化活性，能催化多環芳烴等多種致癌物氧化，生成具有強致癌活性的親電子環氧化物。因此，CYPlAl活性的差異可能會影響雌激素的代謝，與個體易感性有關。4-0冊2主要是由CYPlBlWh代謝而來，為兒茶酚代謝物，具有基因毒效應。其致癌效應在雌激素誘發癌變作用中占主導地位。CYP17基因與雌激素的合成也密切相關，其5’啟動子區的翻譯起始點上游的第34 個堿基處存在著一個T-C (等位基因Al-等位基因A2)的多態位點，當等位基因A2存在時可導致雌激素水平改變，增加子宮內膜癌易感性。基因多態性的存在，并不直接造成細胞的癌變及腫瘤的發生，可能會賦予個體對某種特殊的環境因素易感。基因與環境暴露因素之間可能存在相互影響，研究基因多態性與子宮內膜癌發生的相互作用，對個體腫瘤易感性的評價會更全面，更具有生物合理性。因此，建立簡單、快速的女性子宮內膜癌易感風險級別的檢測方法，能夠檢測出女性在子宮內膜癌發生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出子宮內膜癌易感基因的女性高危人群，從而有針對性的預防和治療子宮內膜癌，這對于降低女性子宮內膜癌的發病率有非常重要的意義。

發明內容
基于CYPlAl 基因的 MspI、CYPlBl 基因的 Leu432Val，CYP17 基因的 MspAl I 的 3 個單核苷酸多態性位點基因型可用來評估女性子宮內膜癌發生風險的生物學功能基礎上， 本發明提供一種女性子宮內膜癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYPlAl 基因的 MspI、CYPlBl 基因的 Leu432Val, CYP17 基因的 MspAl I 的 3 個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；
PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特異性引物對(每條引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·測序反應體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1.檢測試劑盒的使用1、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(I)CYPlAl (MspI)正向引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3 ‘CYPlAl (MspI)反向引物5' AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3 ‘( CYPlBl (Leu432Val)正向引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘CYPlBl (Leu432Val)反向引物5' AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3 ‘(3)CYP17(MspAl I)正向引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'CYP17 (MspAl I)反向引物5 ‘ AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3 ‘PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq 酶 0. 125 μ 1、DNA 模板 1 μ 1 (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C 1分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。
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4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(I)CYPlAl (MspI)測序引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3 ‘( CYPlBl (Leu432Val)測序引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘(3)CYP17(MspAl I)測序引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 測序引物lul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的轉速離心30min，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min離心15min，輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點的基因型。實施例2.對人們進行預防子宮內膜癌易感基因無創檢測的服務1.采樣及抽提DNA由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提2.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的CYPlAl基因的MspI、CYPlBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I的3個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這3個SNPs位點的基因型。3.子宮內膜癌女性高危人群風險評估通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具子宮內膜癌風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者CYPlAl基因的Mspl、CYPlBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I 基因上SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別， 并由醫師向受檢者詳細說明和解讀子宮內膜癌易感基因無創檢測報告單。
權利要求
1.一種檢測子宮內膜癌易感基因的無創檢測試劑盒，其特征在于檢測CYPlAl基因的 MspI,CYPIBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對CYPlAl 基因的MspI、CYPIB1基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I的3個單核苷酸多態性位點， 能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對CYPlAl基因的MspI、CYPlBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAlI的3個單核苷酸多態性位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述3個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下(1)CYPlAl(MspI)正向引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3 ‘CYPlAl (MspI)反向引物5 ‘ AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3 ‘(2)CYPlBl(Leu432Val)正向引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3‘CYPlBl (Leu432Val)反向引物5 ‘ AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3 ‘(3)CYP17 (MspAl I)正向引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'CYP17 (MspAl I)反向引物5 ‘ AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3 ‘
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下(1)CYPlAl(MspI)測序引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3 ‘(2)CYPlBl(Leu432Val)測序引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3‘(3)CYP17 (MspA 1 I)測序引物5 ‘ CCCATACGAACCGAATAGA 3 ‘
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1)PCR反應體系10XPCR反應緩沖液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測子宮內膜癌的易感基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYP1A1基因的MspI、CYP1B1基因的Leu432Val，CYP17基因的MspA1 I的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與子宮內膜癌發生密切相關的3個單核苷酸多態性位點的基因型來評估受檢者子宮內膜癌發生的風險級別，指導女性有針對性的預防子宮內膜癌的發生。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102559903SQ20121002199
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月1日 優先權日2012年2月1日
發明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司