專利名稱：胃癌易感基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種胃癌易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估胃癌發病的風險級別，并作為預防和治療胃癌的方向指導。
背景技術：
胃癌是嚴重危害人類健康的疾病，居全球腫瘤發病和癌癥死亡率的第二位。胃癌的發生主要與環境因素、油門螺旋桿菌和遺傳等因素有關。研究表明，葉酸代謝與胃癌的發生發展有關，而亞甲基四氫葉酸還原酶在葉酸代謝中占據中心地位。該基因發生突變，使得酶活性降低，葉酸代謝趨緩，細胞內甲基化水平則下降，影響了 DNA甲基化及DNA損傷修復機制，最終使胃癌發生風險上升。國內外大量的研究均表明，MTHFR基因 C677T多態與胃癌的發生相關，因此可以用于胃癌的遺傳風險檢測。研究表明，幽門螺桿菌感染胃部產生炎癥，同時引起胃酸分泌減少，容易誘發胃萎縮，從而導致胃癌。TNF-α參與此炎癥反應，引起炎癥反應加劇。編碼TNF-α蛋白的基因發生G-308A突變后，似的其表達量上升，提高了個體罹患胃癌的風險。國內外研究表明， TNF- a AA和GA基因型與胃癌發生存在顯著關聯，同時該基因型與幽門螺桿菌感染、EB病毒、白細胞介素等因素存在基因-基因互作和基因-環境互作關系。此外編碼TNF-β蛋白的基因發生Α252突變后，使得相鄰的TNF- α基因表達量上升，提高了個體罹患胃癌的風險。國內研究表明，TNF-β AA和GA基因型與胃癌發生存在顯著關聯。同時該基因型與幽門螺桿菌感染等因素存在基因-環境互作關系。hMLHl基因是錯配修復基因中的一種，參與DNA復制過程中堿基錯配修復通路，具有穩定修復復合物和指導隨后的修復過程的作用。hMLHl基因T1151A位點T到A突變改變了該基因的氨基酸序列，影響錯配修復酶的識別修復能力，使癌基因和抑癌基因的突變率上升，最終導致胃癌的發生。國內關聯研究表明該突變與胃癌的患病相關。因此，hMLHl基因T1151A多態位點可用于胃癌的遺傳易感性檢測。GSTMl全稱Glutathione S-transferase Ml,中文名為谷胱;甘妝硫轉移酶Ml。該基因最為常見的變異為整個基因的缺失，該缺失型導致整個基因的功能喪失，與多種癌癥的發病相關，會大大提高癌癥的發病率。原因可能就是對環境毒物和致癌物質的易感性提高導致的。分子生物學研究也表明，GSTTl缺失型的個體整個基因缺失并喪失功能，從而也相當于增加了環境毒素和致癌物質的濃度，提高了個體易患一系列類型癌癥的風險。綜上所述，鑒于MTHFR基因，TNF-α基因，TNF-β基因，hMLHl基因上，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)在胃癌變過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出受檢者在胃癌發生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患胃癌的高危人群，從而有針對性的預防和治療胃癌，這對于降低胃癌的發病率有非常重要的意義。

發明內容
基于MTHFR基因上C677T位點多態性，TNF- α基因上G-308A位點多態性， TNF-β基因上A252G位點多態性，hMLHl基因上Τ1151Α位點多態性，GSTMl基因缺失與否 (Present/Null)位點多態性的5個單核苷酸多態性位點基因型可作為評估胃癌發病的危險因子的基礎上，本發明提供一種胃癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測MTHFR基因上C677T位點多態性，TNF- α基因上G-308A位點多態性， TNF-β基因上A252G位點多態性，hMLHl基因上Τ1151Α位點多態性，GSTMl基因缺失與否 (Present/Nu11)位點多態性的5個單核苷酸多態性位點基因型的特異性弓I物對及DNA測序引物； PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。測序反應體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I.檢測試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(1)MTHFR(C677T)正向引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(2)TNF-a (G-308A)正向引物5' AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCA3'TNF-a (G-308A)反向引物5' AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG3'
(3)TNF-@ (A252G)正向引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'TNF-P (A252G)反向引物5' TTCGTGCTTTGGACTACCG3'(4)hMLHl(T1151A)正向引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'hMLHl(T1151A)反向引物5' TGTCTTATCCTCTGTGACAATGG3'(5)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5 ill ;25mM的dNTP混合液0. 2 yl、 5U/ul Taq 酶 0. 125 yl、DNA 模板 I (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25u I, ddH20 19. 175u I ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(1)MTHFR(C677T)測序引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(2)TNF-a (G-308A)測序引物5' AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCA3'(3)TNF-P (A252G)測序引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'(4)hMLHl(T1151A)測序引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'(5) GSTMl (Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 測序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %こ醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%こ醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點的基因型。實施例2.對人們進行預防胃癌發病的基因無創檢測的服務I.采樣及抽提DNA由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提2.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的MTHFR基因上C677T位點多態性，TNF-α基因上G-308A位點多態性，TNF-β基因上A252G位點多態性，hMLHl基因上 T1151A位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的5個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這5個SNPs位點的基因型。3.胃癌發病高危人群風險評估通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具胃癌易感基因風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者MTHFR基因上C677T位點多態性，TNF-α基因上G-308A位點多態性， TNF-β基因上A252G位點多態性，hMLHl基因上Τ1151Α位點多態性，GSTMl基因缺失與否 (Present/Null)位點多態性的5個基因上SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。 除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀胃癌易感基因無創檢測報告單。
權利要求
1.一種檢測胃癌易感基因無創檢測試劑盒，其特征在于檢測MTHFR基因上C677T位點多態性，TNF- a基因上G-308A位點多態性，TNF- ^基因上A252G位點多態性，hMLHl基因上T1151A位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的5個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP 酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對MTHFR 基因上C67H位點多態性，TNF- a基因上G-308A位點多態性，TNF- P基因上A252G位點多態性，hMLHl基因上T1151A位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的5個單核苷酸多態性位點，能特異性擴增出包含這5個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對MTHFR基因上C67H位點多態性，TNF- a基因上G-308A位點多態性，TNF- ^基因上A252G位點多態性，hMLHl基因上T1151A位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的 5個單核苷酸多態性位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述5個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的5對特異性引物序列如下 (1)MTHFR(C677T)正向引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(2)TNF- a (G-308A)正向引物5' AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCA3'TNF- a (G-308A)反向引物5' AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG3'(3)TNF- ^ (A252G)正向引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'TNF-P (A252G)反向引物5' TTCGTGCTTTGGACTACCG3'(4)hMLHl(Tl 151A)正向引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3' hMLHl (Tl 151A)反向引物5' TGTCTTATCCTCTGTGACAATGG3'(5)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的5條DNA測序引物序列如下(1)MTHFR(C677T)測序引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(2)TNF- a (G-308A)測序引物5' AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCA3'(3)TNF-^(A252G)測序引物5, CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3,(4)hMLHl(Tl 151A)測序引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'(5)GSTMl(Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1)卩0 反應體系10\ 0 反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測胃癌易感基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測MTHFR基因上C677T位點多態性，TNF-α基因上G-308A位點多態性，TNF-β基因上A252G位點多態性，hMLH1基因上T1151A位點多態性，GSTM1基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的5個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與胃癌發生密切相關的5個單核苷酸多態性位點的基因型來評估受檢者胃癌患病的風險級別，并最終根據每一位受檢者的基因檢測結果從基因層面指導受檢者有針對性的預防胃癌的發生，降低胃癌的發病幾率。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102586445SQ20121005363
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司