Graves病基因無創(chuàng)檢測試劑盒（TSHR等基因）的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測Graves病基因無創(chuàng)檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CTLA-4基因上A49G(rs231775)、TSHR基因上rs179247、FcRL3基因上rs7528684的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測與Graves病發(fā)生密切相關的3個單核苷酸多態(tài)性位點的基因型從基因?qū)用鎭碓u估Graves病發(fā)病的風險級別，指導人們提早預防Graves疾病的發(fā)生。本發(fā)明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛無創(chuàng)、避免了交叉感染。測序檢測結果準確可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
【專利說明】Graves病基因無創(chuàng)檢測試劑盒(TSHR等基因)
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及醫(yī)學和生物技術，具體涉及一種Graves病的基因檢測試劑盒，根據(jù)檢測結果從基因?qū)用嬖u估Graves病發(fā)生的風險級別，并且指導Graves病高危人群提早預防和治療。
【背景技術】
[0002]Graves病(GD)是一種伴有甲狀腺激素增多的器官特異性自身免疫性疾病，它的發(fā)生具有一定的遺傳因素。以促甲狀腺素受體抗體(TRAb)陽性、高甲狀腺素血癥、Graves眼病、彌漫性甲狀腺腫和脛前黏液性水腫為特征。Graves病的發(fā)生呈明顯的家族聚集性，患者家族成員的患病風險為正常人群的15倍，而且同卵雙生子的患病一致率顯著高于異卵雙生子。大量的流行病學研究為其遺傳易感提供了確鑿的證據(jù)。單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)指的是基因組序列上的單個堿基突變。作為第三代遺傳學標記，SNP在疾病易感基因的研究中有著重要的意義。通過分子診斷檢測與Graves病發(fā)生密切相關的基因位點就可以提前評估受檢者患Graves病的風險，從而提早預防和治療。
[0003]細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原 4(Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen4，CTLA-4)是一種免疫調(diào)節(jié)分子。近年的研究表明:CTLA-4基因多態(tài)性與多種自身免疫性疾病的發(fā)生風險相關。CTLA-4基因上外顯子I第17密碼子49位點A/G多態(tài)性造成CTLA-4信號肽中編碼氨基酸的改變，從而影響蛋 白翻譯后加工、修飾，使sCTLA-4功能發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)GD患者等位基因G/G和G基因頻率在GD組均較對照組顯著增加，提示CTLA-4G49可能是GD的易感因素，CTLA-4基因可能是GD的易感候選基因。
[0004]促甲狀腺素受體(TSHR)基因能夠編碼一種特異的蛋白質(zhì)TSHR，表達在甲狀腺濾泡細胞表面，調(diào)節(jié)甲狀腺的增殖分化和甲狀腺激素的合成。在Graves病中TSHR基因區(qū)域的遺傳變異可能通過改變正常TSHR的結構、表達量以及翻譯后過程，引起機體針對TSHR的自身免疫反應。今年來，大樣本的研究已經(jīng)明確了 TSHR基因和Graves病的發(fā)生密切相關，其中最值得關注的區(qū)域定位于TSHR基因內(nèi)含子I上。對1000多例Graves病患者和1000多名健康對照者進行TSHR rsl79247基因分型，得到3種基因型:AA、AG、GG，其中病例組AA基因型頻率和A等位基因明顯高于對照組。提示TSHR rsl79247是Graves病的獨立易感位點。
[0005]FcRL3基因包含16個外顯子，在淋巴細胞聚集區(qū)如成熟B細胞中高表達。近年來的國內(nèi)外研究數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)cRL3基因多態(tài)位點不但與GD相關，還與多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕性關節(jié)炎等多種自身免疫性疾病相關。研究發(fā)現(xiàn)FcRL3基因啟動子rs7528684位點存在A / G多態(tài)性，而且⑶病患組的GG基因型和G等位基因頻率均明顯高于正常對照組。提示FcRL3基因可能是GD等自身免疫性疾病的遺傳標志之一。
[0006]因此，建立簡單、快速的Graves病易感基因無創(chuàng)檢測方法,能夠檢測出Graves病發(fā)生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患Graves病的高危人群，有針對性的進行孕期檢測和指導，對于降低人群得病率、保障大眾的安全健康具有非常重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于CTLA-4 基因上 A49G(rs231775)、TSHR 基因上 rsl79247、FcRL3 基因上rs7528684的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型可用來評估Graves病發(fā)病風險級別，本發(fā)明提供一種Graves病基因無創(chuàng)檢測試劑盒。
[0008]該試劑盒包括:
檢測 CTLA-4 基因上 A49G(rs231775) ,TSHR 基因上 rsl79247、FcRL3 基因上 rs7528684的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；
PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；
PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0009]本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:
PCR 反應體系:10 XPCR 反應緩沖液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul ；
PCR 產(chǎn)物純化體系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20 3.875ul ；測序反應體系:25%BigDye mix lul ；3.2uM DNA 測序引物 lul ；125mM EDTA 溶液 lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul ；
本試劑盒供一人份檢測使用，`試劑盒的保存溫度為_20°C。
【具體實施方式】
[0010]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0011]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0012]實施例1.檢測試劑盒的使用。
[0013]1、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0014]2、PCR擴增反應
使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對:
(1)CTLA-4 (A49G)正向引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA3’
CTLA-4 (A49G)反向引物:5’GAATACAGAGCCAGCCAAGC3’
(2)TSHR (rsl79247)正向引物:5’ TCTAAACTTCCCACATCAC 3’
TSHR (rsl79247)反向引物:5’ ATACTGCCATCTCAAAGCC 3’
(3 ) FcRL3 (rs7528684)正向引物:5’ AATGTCTCCAAGACTGTGCC3’
FcRL3 (rs7528684)反向引物:5’GGTGGAACCTCTTTGATTGC3’。
[0015]PCR擴增的反應體系為:10 X PCR反應緩沖液2.5ml ；25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板Iml (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ml、ddH20 19.175ml。
[0016]反應條件為:94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環(huán)28次，最后72°C延長5分鐘以上。
[0017]3、PCR擴增產(chǎn)物純化
使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去離子水 3.875ul。
[0018]在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。
[0019]4、DNA測序反應
使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物:
(1)CTLA-4 (A49G)測序引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA 3’
(2)TSHR (rsl79247)測序引物:5’ TCTAAACTTCCCACATCAC 3’
(3)FcRL3 (rs7528684)測序引物:5’AATGTCTCCAAGACTGTGCC3’。
[0020]反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA測序引物lul，去離子水 2ul。
[0021]在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98°C 2min，進行25個循環(huán)的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0022]反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。
[0023]5、基因型分析
熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。
[0024]實施例2.為人群進行Graves病基因無創(chuàng)檢測的服務。
[0025]1.采樣及抽提DNA
由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。
[0026]2.基因型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的CTLA-4基因上A49G (rs231775)、TSHR基因上rsl79247、FcRL3基因上rs7528684的3個單核苷酸多態(tài)性位點分別進行DNA測序，確定這3個SNPs位點的基因型。
[0027]3.Graves病高危人群風險評估分析
通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具Graves病風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者CTLA-4基因上A49G(rs231775)、TSHR基因上rs 179247、FcRL3基因上rs7528684的SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據(jù)受檢者的風險級別，并由醫(yī)師向受檢者詳細說明和解讀Graves病基因無創(chuàng)檢測報告單。
【權利要求】
1.一種篩查Graves病高危人群的基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于:檢測CTLA-4基因上A49G(rs231775)、TSHR基因上rsl79247、FcRL3基因上rs7528684的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對CTLA-4基因上A49G (rs231775)、TSHR基因上rsl79247、FcRL3基因上rs7528684的3個單核苷酸多態(tài)性位點，能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測序引物是針對CTLA-4基因上A49G(rs231775)、TSHR基因上rsl79247、FcRL3基因上rs7528684的3個單核苷酸多態(tài)性位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述3個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據(jù)權利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下: (1)CTLA-4 (A49G)正向引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA3’ CTLA-4 (A49G)反向引物:5’ GAATACAGAGCCAGCCAAGC3’ (2)TSHR (rsl79247)正向引物:5’ TCTAAACTTCCCACATCAC 3’ TSHR (rsl79247)反向引物:5’ ATACTGCCATCTCAAAGCC 3’
(3 ) FcRL3 (rs752 8684)正向引物:5’ AATGTCTCCAAGACTGTGCC3’
FcRL3 (rs7528684)反向引物:5’GGTGGAACCTCTTTGATTGC3’。
5.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下: (1)CTLA-4 (A49G)測序引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA 3’ (2)TSHR (rsl79247)測序引物:5’ TCTAAACTTCCCACATCAC 3’
(3)FcRL3 (rs7528684)測序引物:5’ AATGTCTCCAAGACTGTGCC3’。
6.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括: (1)?0?反應體系:10父？0?反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 產(chǎn)物純化體系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)測序反應體系:25%BigDye mixlul, 3.2uM DNA測序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul,70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710424SQ201210373800
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年10月2日 優(yōu)先權日:2012年10月2日
【發(fā)明者】石慧林 申請人:解碼（上海）生物醫(yī)藥科技有限公司