專利名稱：肺鱗癌易感基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及ー種肺鱗癌易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估肺鱗癌發病的風險級別，并作為預防和治療肺鱗癌的方向指導。
背景技術：
肺鱗癌又稱為鱗狀上皮細胞癌，包括梭形細胞癌，是最常見的類型，約占原發性肺癌的40%-50%。肺鱗癌多見于老年男性，與吸煙關系非常密切。肺鱗癌的治療多數病人確診時已是肺癌晩期，咳嗽、咳嗽胸痛、消瘦、貧血等是小細胞肺癌的主要臨床表現。該疾病是多基因疾病，研究發現，XPD基因，GSTTl基因在肺鱗癌變過程中有著不可忽視的作用，這為提前檢測出肺鱗癌發病的高危人群提供了科學依據。
著色性干皮病基因(XPD)是ー種重要的DNA損傷修復基因，參與DNA核苷酸切除修復。XPD基因幾個核苷酸序列中存在多態性，其中751Lys/Gln多態性比較常見。當XPD基因的第751位Lys — Gln吋，DNA損傷修復能力降低，基因組穩定性下降，抵抗致癌物質或其他外界因素破壞作用的能力降低，増加了癌癥發病風險。分子生物學研究表明，攜帶GSTTl缺失型的個體整個基因缺失并喪失功能，從而相當于增加了環境毒素和致癌物質的濃度，提高了個體罹患一系列類型癌癥的風險。國內外研究表明，攜帯GSTTl缺失型的個體，肺癌的風險增加，GSTTl缺失型是中國人群重要的肺癌遺傳易感因素之一。綜上所述，鑒于xro基因，GSTTl基因在肺鱗癌變過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出受檢者在肺鱗癌發生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患肺鱗癌的高危人群，從而有針對性的預防和治療肺鱗癌，這對于降低肺鱗癌的發病率有非常重要的意義。

發明內容
基于XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的2個單核苷酸多態性位點基因型可作為評估肺鱗癌發病的危險因子的基礎上，本發明提供一種肺鱗癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的2個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%こ醇溶液、70%こ醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括
PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul TaqDNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ;ddH203. 875ul。測序反應體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液Iul ; 100% こ醇溶液 15ul ;70% こ醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。 除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I.檢測試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(l)XPD(Lys751Gln)正向引物5' TCCTGCGATTAAAGGCTGTG3'XPD(Lys751Gln)反向引物5' TACGGACATCTCCAAATTCATTC3'(2) GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、5U/ul Taq 酶 O. 125 μ 1、DNA 模板 I μ I (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 O. 25 μ I、ddH20 19. 175μ I ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(l)XPD(Lys751Gln)測序引物5' TCCTGCGATTAAAGGCTGTG3'(2) GSTTl (Present/Null)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物Iul，25% Bigdye mixlul,3. 2uMDNA測序引物Iul，去離子水2ul。
在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %こ醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%こ醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。
實施例2.對人們進行預防肺鱗癌發病的基因無創檢測的服務I.采樣及抽提DNA由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提2.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的2個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這2個SNPs位點的基因型。3.肺鱗癌發病高危人群風險評估通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具肺鱗癌易感基因風險評估分析報告単。報告中詳細說明了受檢者XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的2個基因上SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級另O，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀肺鱗癌易感基因無創檢測報告単。
權利要求
1.ー種檢測肺鱗癌易感基因無創檢測試劑盒，其特征在干檢測xro基因上Lys751Gln, GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的2個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%こ醇溶液、100%こ醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的2個單核苷酸多態性位點，能特異性擴增出包含這2個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的2個單核苷酸多態性位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述2個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的2對特異性引物序列如下(1)XPD (Ly s75 IGln )正向引物5’ TCCTGCGATTAAAGGCTGTG3’XPD (Lys751Gln)反向引物5’ TACGGACATCTCCAAATTCATTC3’(2)GSTTl (Null/Present)正向引物5’ TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3’GSTTl (Null/Present)反向引物5’ TCACCGGATCATGGCCAGCA3’。
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的2條DNA測序引物序列如下 (1)XPD (Lys751Gln)測序引物5’ TCCTGCGATTAAAGGCTGTG3’(2)GSTTl (Present/Null)測序引物5’ TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3’。
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括 (1) 0 反應體系10父？0 反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶O. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。
(2)PCR 產物純化體系I U / ul SAP 酶 O. 75ul，10 U / ul ExoI 酶 O. 375ul，ddH203.875ul。
(3)測序反應體系25%BigDye mixlul，3.2uM DNA測序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% こ醇溶液 15ul,70% こ醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測肺鱗癌易感基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測XPD基因上Lys751Gln，GSTT1基因缺失與否(Present/Null)的2個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與肺鱗癌發生密切相關的2個單核苷酸多態性位點的基因型來評估受檢者肺鱗癌患病的風險級別，并最終根據每一位受檢者的基因檢測結果從基因層面指導受檢者有針對性的預防肺鱗癌的發生，降低肺鱗癌的發病幾率。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102690883SQ20121005363
公開日2012年9月26日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司