專利名稱：一種兩階段pH控制高產(chǎn)a-酮戊二酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)α -酮戊二酸的發(fā)酵策略，特別是一種兩階段pH控制策略。
背景技術：
α -酮戊二酸(a -ketoglutaric acid, a -KG)是一種重要的二元羧酸廣泛的用于食品、藥品、精細化工等工業(yè)生產(chǎn)中。目前，α-酮戊二酸生產(chǎn)方式主要是化學合成法?；瘜W合成法具有副產(chǎn)物過多，副產(chǎn)物中的有毒物質氰化物及殘留的有機化合物增加了 α -酮戊二酸后提取難度及費用，且限制了 α-酮戊二酸的應用范圍。微生物發(fā)酵法具有高純度、 環(huán)境友好等優(yōu)點，但是發(fā)酵法生產(chǎn)α -酮戊二酸生產(chǎn)強度低的現(xiàn)實讓工業(yè)生產(chǎn)毫無懸念的選擇化學合成法。此前，國內外的學者從菌株選育，培養(yǎng)基成分優(yōu)化，培養(yǎng)條件優(yōu)化等水平研究 α -酮戊二酸的積累過程，以期獲得高產(chǎn)α -酮戊二酸的菌株和過量積累α -酮戊二酸的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。我們研究小組從土壤中篩選出一株高產(chǎn)α-酮戊二酸的Y. Iip0Iytica CCTCC NO. Μ207143，經(jīng)過一些列的單因素優(yōu)化發(fā)現(xiàn)此菌的生產(chǎn)強度仍然達不到工業(yè)化的需求。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題提供一種兩階段pH控制高產(chǎn)-酮戊二酸的方法。本發(fā)明的技術方案是以解脂亞洛酵母(Yarrowia lipolytica) CCTCC NO. M207143 為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵前期添加CaCO3為pH緩沖劑促進菌體生長，發(fā)酵后期以NaOH為pH調節(jié)劑，維持菌株的最適產(chǎn)酸范圍，實現(xiàn)α-酮戊二酸過量積累的方法。解脂亞洛酵母 (Yarrowia lipolytica) CCTCC NO. M207143 在 201010302441. 7 專利申請中提交 CCTCC 保藏。詳細方案為以CCTCC N0.M207143為出發(fā)菌株，接種到種子培養(yǎng)中，28°C培養(yǎng)10 天，至分生孢子成熟；無菌水洗下孢子，稀釋到IO7個/L ;以4%的體積比轉接孢子懸浮液至前培養(yǎng)培養(yǎng)基，28°C，400rpm培養(yǎng)40h ;以10 %的體積比轉接前培養(yǎng)種子至發(fā)酵培養(yǎng)基， 280C，400rpm維持通氣量I. 5vvm,添加20g/L CaCO3為發(fā)酵液pH緩沖劑培養(yǎng)至發(fā)酵液pH下降至2. 5，再以4mol/LNaOH溶液維持發(fā)酵液pH = 2. 5培養(yǎng)至168h。產(chǎn)孢子培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖1，氯化鉀I. 8，酵母汁2. 5，醋酸鈉8. 2，瓊脂 15，pH自然。種子培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂 O. 5。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):甘油100，硫酸銨3，磷酸二氫鉀3，七水硫酸鎂I. 2，氯化鈉O. 5，磷酸氫二鉀O. I，鹽酸硫胺O. 2X 10_6。細胞干重測定取一定量的菌懸液置于IOmL容量瓶中，加2mL鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣，加入去離子水定容至10mL，搖勻，UV 7500型可見分光光度計，于570nm處比色測 OD值，用細胞干重標準曲線算得細胞干重。
甘油、丙酮酸和α -酮戊二酸濃度的測定高效液相色譜(HPLC)儀器Agilent 1100高效液相色譜儀(紫外可見檢測器、示差擇光檢測器)；色譜柱AminexHPX-87H ion exchange column ；流動相5mMH2SO4 ；流速0.6mL/min ；柱溫35°C;進樣量5yL;紫外檢測器波長210nm。樣品制備500 μ L發(fā)酵液在10，OOOrpm下離心IOmin,取100 μ L上清液轉入5mL
容量瓶中，定容，O. 22 μ m濾膜過濾，濾液備用液相色譜分析。本發(fā)明以一株能以甘油為唯一碳源，過量積累α -酮戊二酸的Y. Iipolytica CCTCC NO. Μ207143為出發(fā)菌株，利用兩階段pH控制策略，前期以20g/LCaC03為pH緩沖劑過量生長菌體，后期以4mol/LNaOH為發(fā)酵液pH調節(jié)劑維持產(chǎn)酸最適pH范圍。培養(yǎng)168h 后，α-酮戊二酸產(chǎn)量達到53. 4g/L，比對照組分別提高了 142. 7%，32. 5% ;丙酮酸的產(chǎn)量降到21. 3g/L，比對照組分別降低了 42. 3%，33. 0%。
具體實施例方式對照實施例1維持發(fā)酵液pH = 4. 5積累α -酮戊二酸本發(fā)明所用菌種為維生素B1缺陷型解脂亞洛酵母(CCTCC NO. Μ207143)。先將在產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)10天的解脂亞洛酵母孢子用無菌水洗下，以4%的體積比轉接孢子懸浮液至前培養(yǎng)培養(yǎng)基，280C，400rpm培養(yǎng)40h ；以10%的體積比轉接前培養(yǎng)種子至發(fā)酵培養(yǎng)基，280C，400rpm維持通氣量I. 5vvm,用4M NaOH維持pH為4. 5培養(yǎng)168h。對照實施例2CaC03為pH緩沖劑積累α -酮戊二酸將產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)10天的解脂亞洛酵母孢子無菌水洗下，以4%的體積比轉接孢子懸浮液至前培養(yǎng)培養(yǎng)基，280C，400rpm培養(yǎng)40h ；以10%的體積比轉接前培養(yǎng)種子至發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C，400rpm維持通氣量I. 5vvm，添加20g/L CaCO3為發(fā)酵液pH緩沖劑， 發(fā)酵168h。實施例1兩階段pH控制策略過量積累α -酮戊二酸將產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)10天的解脂亞洛酵母孢子無菌水洗下，以4%的體積比轉接孢子懸浮液至前培養(yǎng)培養(yǎng)基，280C，400rpm培養(yǎng)40h ；以10%的體積比轉接前培養(yǎng)種子至發(fā)酵培養(yǎng)基，28 V，400rpm維持通氣量I. 5vvm,添加20g/L CaCO3為發(fā)酵液pH緩沖劑培養(yǎng)至發(fā)酵液pH下降至2. 5，再以4mol/LNaOH溶液維持發(fā)酵液pH為2. 5培養(yǎng)至168h。兩階段pH控制策略與對照組相比(1)對照實施例1(維持pH4. 5)中副產(chǎn)物丙酮酸產(chǎn)量為36. 9g/L，對照實施例2(CaC03作為緩沖劑)中副產(chǎn)物丙酮酸產(chǎn)量為31. 8g/L，實施例I (兩階段PH控制)中副產(chǎn)物丙酮酸產(chǎn)量為21. 3g/L，比對照組分別降低了 42. 3%， 33.0% ;(2)對照實施例1(維持pH4. 5)中α -酮戊二酸產(chǎn)量為22. Og/L，對照實施例 2 (CaCO3作為緩沖劑)中α -酮戊二酸產(chǎn)量為40. 3g/L，實施例I (兩階段控制pH)中α -酮戊二酸產(chǎn)量為53. 4g/L，比對照組相比分別提高了 142. 7%，32. 5%。
權利要求
1.一種兩階段pH控制高產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，其特征在于以解脂亞洛酵母 (Yarrowia lipolytica) CCTCC NO. Μ207143為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵前期以CaCO3為pH緩沖劑，后期用NaOH維持pH在2. 5。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于具體步驟為以解脂亞洛酵母為出發(fā)菌株， 接種到產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)10天至分生孢子成熟；生理鹽水洗下分生孢子，以4%的體積比轉接至前培養(yǎng)培養(yǎng)基，28°C，400rpm培養(yǎng)40h ;以10%的體積比轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基， 280C，400rpm,通氣量I. 5vvm,添加20g/L CaCO3為發(fā)酵液pH緩沖劑培養(yǎng)至發(fā)酵液pH下降至2. 5，再以4mol/LNaOH溶液維持發(fā)酵液pH在2. 5培養(yǎng)至168h。
3.根據(jù)權利要求書2所述的方法，其特征是產(chǎn)孢子培養(yǎng)基成分(g/L):葡萄糖1，氯化鉀I. 8，酵母汁2. 5，醋酸鈉8. 2，瓊脂15，pH自然。
4.根據(jù)權利要求書2所述的方法，其特征是前培養(yǎng)培養(yǎng)基成分(g/L):葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂O. 5。
5.根據(jù)權利要求書2-4任一所述的方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L):甘油100， 硫酸銨3，磷酸二氫鉀3，七水硫酸鎂I. 2，氯化鈉O. 5，磷酸氫二鉀O. I，鹽酸硫胺O. 2X 10_6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種兩階段pH控制高產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，屬于發(fā)酵工程領域。本發(fā)明采用兩階段控制pH調控發(fā)酵過程，以解脂亞洛酵母(Yarrowia lipolytica)CCTCC NO.M207143為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵前期以CaCO3為pH緩沖劑，后期用NaOH維持pH＝2.5，大量積累α-酮戊二酸，實驗室規(guī)模α-酮戊二酸產(chǎn)量達到53.4g/L，比恒定pH＝2.5時，α-酮戊二酸產(chǎn)量提高了142.7％；比僅用CaCO3為pH緩沖劑，α-酮戊二酸產(chǎn)量提高了32.5％；發(fā)酵后期低pH值能降低染菌的概率，減少NaOH用量，利于下游產(chǎn)品的提??；具有廣闊的工業(yè)應用前景。
文檔編號C12P7/50GK102586347SQ20121005610
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月6日 優(yōu)先權日2012年3月6日
發(fā)明者余宗鐘, 周景文, 堵國成, 陳堅 申請人:江南大學