專利名稱：馬動(dòng)脈炎病毒的rt-lamp檢測(cè)試劑及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及馬動(dòng)脈炎病毒的檢測(cè)技術(shù)，具體涉及馬動(dòng)脈炎病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒。
背景技術(shù)：
馬病毒性動(dòng)脈炎是由馬動(dòng)脈炎病毒(Equine viral arteritis, EVA)引起的一種通過(guò)呼吸道或生殖器官傳播的傳染病，是危害養(yǎng)馬業(yè)的重大疾病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列入檢疫名錄。馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)屬于套式病毒目(Nidovirale)、動(dòng)脈炎病
毒科(Arteri--viridae)、動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus),它是線性單股正鏈RNA病毒，
含有至少9個(gè)以上重疊的開(kāi)放閱讀框架，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白小囊膜蛋白(E、GP2b、GP3和 GP4)、核衣殼蛋白(N)、膜基質(zhì)蛋白(M)、主要囊膜蛋白GP5。1957年Doll等在美國(guó)俄亥俄州 Bucyrus首次分離到該病毒，目前分布遍及全世界，多數(shù)為亞臨床感染，但良種馬易發(fā)病。病毒只有I個(gè)血清型，有歐、美兩個(gè)代表株，歐洲株為CW株，美洲株為Bucyrus株。近年來(lái)，我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展和人們生活水平不斷提高，喜愛(ài)養(yǎng)馬和賽馬的人也越來(lái)越多，隨著馬術(shù)比賽國(guó)際化交流日益增多，該病的傳播風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越高。為防治該病的傳播，有必要建立一種快速、高效、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。目前EVA的檢測(cè)方法主要有病毒中和試驗(yàn)、病原鑒定、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA、)和RT-PCR檢測(cè)等，其中病毒中和試驗(yàn)和病原鑒定(僅限于精液)是OIE國(guó)際貿(mào)易指定試驗(yàn)方法，授權(quán)公告號(hào)為CN1851463的發(fā)明專利，則公開(kāi)了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)EAV方法，RT-PCR檢測(cè)如杜建等的馬動(dòng)脈炎病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立(中國(guó)動(dòng)物檢疫，2005，(5) :30-32);但上述方法均存在不同的缺點(diǎn)，例如，所需試驗(yàn)周期較長(zhǎng)、對(duì)儀器要求要求高、操作繁瑣、無(wú)法現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，且靈敏度不高、特異性不強(qiáng)、準(zhǔn)確性較低、易受檢測(cè)材料限制等。研究建立特異、敏感、可對(duì)馬病毒性動(dòng)脈炎病毒進(jìn)行方便、準(zhǔn)確檢測(cè)的方法，在檢疫方面具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了馬動(dòng)脈炎病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒，該RT-LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒具有高靈敏度、高特異性、操作簡(jiǎn)單、對(duì)儀器要求簡(jiǎn)單和結(jié)果易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，方便適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；為馬病毒性動(dòng)脈炎的早期防治提供技術(shù)支持。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為馬動(dòng)脈炎病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑，包括F3引物溶液、B3引物溶液、BIP引物溶液和FIP引物溶液，所述F3引物溶液含核苷酸序列為GCCTCGTCTT CGGTCCAT的F3引物，所述B3引物溶液含核苷酸序列為CGCCCGTTTC GAAAAGAGG的B3引物，所述BIP引物溶液含核苷酸序列為T(mén)TGAGCGGGG GATGGGAACA CATCGCCAAC TGGTGGTAG的BIP引物，所述FIP引物溶液含核苷酸序列為ACTCAGATAG TGGTTCGCGG CGTCTTGACG CCATCGACAA G 的 FIP 引物。
引物系選擇馬動(dòng)脈炎病毒膜蛋白M基因的保守片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用 PrimerExploer V4 軟件(http://primerexplorer. jp/elamp4. O. 0/index, html)分析、設(shè)計(jì)和合成；將合成的多組內(nèi)外引物最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)，得到最合適的上述F3、B3、BIP、FIP 引物；引物由上海生工合成。該RT-LAMP檢測(cè)試劑組成100 X 25 μ I反應(yīng)體系的試劑盒10 X ThermoPol緩沖液2. 5 μ 1，濃度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1，濃度I. 5mM的dNTP 2 μ 1，濃度5 M的甜菜堿(Betaine)2l·! I，濃度25 mM的MgCl2Iy I，濃度都為10 μ M的F3引物溶液和B3引物溶液各0.5 μ 1，濃度都為10μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ I。25 μ I檢測(cè)反應(yīng)體系時(shí)樣品DNA模板2 μ 1，余量用雙蒸水補(bǔ)足。ThermoPol緩沖液、dNTP液、Bst DNA聚合酶液和Betaine均購(gòu)于TaKaRa公司。該RT-LAMP檢測(cè)試劑組成的試劑盒中還可以有陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照液，陽(yáng)性對(duì)照液含有馬動(dòng)脈炎病毒陽(yáng)性cDNA，陰性對(duì)照液為雙蒸水，用以對(duì)比、驗(yàn)證檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于馬動(dòng)脈炎病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒，包括含核苷酸序列為 TTGAGCGGGG GATGGGAACA CATCGCCAAC TGGTGGTAG 的 BIP 引物溶液，含核苷酸序列為CGCCCGTTTC GAAAAGAGG的B3引物溶液、含核苷酸序列為ACTCAGATAG TGGTTCGCGG CGTCTTGACG CCATCGACAA G 的 FIP 引物溶液，含核苷酸序列為 GCCTCGTCTT CGGTCCAT的F3引物溶液、試劑盒中還有IOXThermoPol緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP、甜菜堿和MgCl2,該RT-LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒對(duì)馬動(dòng)脈炎病毒具有高靈敏度，高特異性，操作簡(jiǎn)單方便只需要簡(jiǎn)單的水浴鍋即可，對(duì)儀器要求簡(jiǎn)單無(wú)需昂貴的PCR儀或熒光PCR儀的投入，結(jié)果易于觀察染料直接肉眼觀察結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)1個(gè)小時(shí)就完成檢測(cè)；為馬病毒性動(dòng)脈炎的早期防治提供技術(shù)支持。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例I、引物設(shè)計(jì)、篩選和合成選擇馬動(dòng)脈炎病毒膜蛋白M基因的保守片段(GENBANK，登陸號(hào)為 DQ846750)為靶目標(biāo)，應(yīng)用 PrimerExploer V4 軟件(http:// primerexplorer. jp/elamp4. O. 0/index, html)分析、設(shè)計(jì)和合成；將合成的多組內(nèi)外引物最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)(特異性和靈敏性試驗(yàn))，得到最合適的核苷酸序列為GCCTCGTCTT CGGTCCAT的F3引物、核苷酸序列為CGCCCGTTTC GAAAAGAGG的B3引物、核苷酸序列為 TTGAGCGGGG GATGGGAACA CATCGCCAAC TGGTGGTAG 的 BIP 引物、核苷酸序列為ACTCAGATAG TGGTTCGCGG CGTCTTGACG CCATCGACAA G 的 FIP 引物。實(shí)施例2、RT-LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒以上述F3引物、B3引物、BIP引物和FIP引物分別配制成引物濃度都為IOyM的F3引物溶液、Β3引物溶液、BIP引物溶液和FIP引物溶液；并組成100Χ25μ I反應(yīng)體系的試劑盒=IOXThermoPol緩沖液2. 5μ1，濃度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1，濃度2. 5mM的dNTP 2 μ 1，濃度5 M的甜菜堿(Betaine) 2μ I ，濃度25 mM的MgCl2I μ I，濃度都為ΙΟμΜ的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5μ1，濃度都為10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ I。實(shí)施例3、特異性試驗(yàn)用QIAGEN核酸提取試劑盒分別提取馬動(dòng)脈炎病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、赤羽病病毒的核酸。然后用cDNA合成試劑盒(購(gòu)于大連寶生生物)對(duì)提取的核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄5 XAMV Buffer 4μ L,2. 5mM dNTP Mixture 5 μ L， 20 μ M 9N 隨機(jī)引物 I μ L，Rnase Inhibitor 0. 5 μ L, AMV Rtase I μ L，提取的 RNA 核酸 I μ L，DEPC處理的H2O補(bǔ)齊20 μ L ;將反應(yīng)溶液輕輕混勻，室溫放置lOmin，42°C水浴保溫I 小時(shí)，后將反應(yīng)管放入冰中冷卻2min，所得產(chǎn)物為cDNA模板，-20°C保存。再用實(shí)施例2的 RT-LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒組成25 μ I反應(yīng)體系10 X ThermoPol緩沖液2. 5 μ I，濃度8 U /μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1，濃度2. 5mM的dNTP 2μ1，濃度5 M的甜菜堿(Betaine) 2μ I，濃度25 mM的MgCl2I μ I，濃度都為10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5 μ 1， 濃度都為10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ 1，cDNA模板2 μ 1，余量用雙蒸水補(bǔ)足；在63 °C水浴恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)I h，擴(kuò)增結(jié)束后擴(kuò)增產(chǎn)物中加入IyL SYBR Green I觀察顏色變化，結(jié)果馬動(dòng)脈炎病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物呈綠色熒光，豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、赤羽病病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物都無(wú)顏色變化，說(shuō)明本發(fā)明的RT-LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒對(duì)馬動(dòng)脈炎病毒特異性高。實(shí)驗(yàn)室也可以取5 UL擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物上樣于I. 5%的瓊脂糖膠電泳進(jìn)行細(xì)致檢測(cè)，馬動(dòng)脈炎病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物出條帶并見(jiàn)到綠色熒光，其它病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)條帶，也無(wú)綠色熒光。實(shí)施例4、靈敏性試驗(yàn)核酸提取、cDNA合成檢測(cè)和恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)與實(shí)施例3相同，所不同的只是對(duì)馬動(dòng)脈炎病毒的cDNA模板進(jìn)行梯度稀釋成下述濃度進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)
O.0012pg、0.012pg、0. 12pg、l. 2pg、12pg,結(jié)果O. 12pg也可以觀察到顏色變化,說(shuō)明本發(fā)明的RT-LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒對(duì)馬動(dòng)脈炎病毒靈敏性高，靈敏度比依杜建等建立的馬動(dòng)脈炎病毒RT-PCR檢測(cè)方法高出100倍，具體杜建等的檢測(cè)方法在此不作敘述。實(shí)施例5、反應(yīng)體系的優(yōu)化與實(shí)施例4基本相同，只是25 μ I反應(yīng)體系中，分別對(duì)濃度25mM的1%(12用0、1、2、3、4、5μ I擴(kuò)增反應(yīng)試驗(yàn)，對(duì)濃度10 μ M的F3引物溶液和 Β3 引物溶液用 O. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1 μ I 擴(kuò)增反應(yīng)試驗(yàn)，對(duì)濃度 10 μ M 的BIP引物溶液和FIP引物溶液用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μ I擴(kuò)增反應(yīng)試驗(yàn)，對(duì)濃度5 M 的甜菜堿用0、1、2、3、4、5μ I擴(kuò)增反應(yīng)試驗(yàn)，對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行61、62、63、64、65°C擴(kuò)增反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果MgCl2用1μ 1，F(xiàn)3引物溶液和Β3引物溶液都用O. 5 μ 1，BIP引物溶液和FIP引物溶液用4 μ 1，甜菜堿用2 μ 1，反應(yīng)溫度為63°C為優(yōu)，所以建立10XThermoPol緩沖液
2.5 μ 1，濃度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1，濃度I. 5mM的dNTP 2 μ 1，濃度5 M的甜菜堿(Betaine) 2μ I，濃度25 mM的MgCl2I μ I，濃度都為10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5 μ 1，濃度都為10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ I反應(yīng)體系的試劑盒；訪試劑盒也可以是200X25 μ I反應(yīng)體系，300 X 25 μ I反應(yīng)體系，或100 X 20 μ I反應(yīng)體系等，在此不一一舉例。實(shí)施例6、應(yīng)用取馬血、鼻腔分泌物等進(jìn)行與實(shí)施例3相同的核酸提取、cDNA合成檢測(cè)和恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，，若擴(kuò)增產(chǎn)物中呈綠色熒光，則該馬感染有馬動(dòng)脈炎病毒，已患或可能會(huì)患馬病毒性動(dòng)脈炎，需及時(shí)預(yù)防和治療。
權(quán)利要求
1.馬動(dòng)脈炎病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑，包括F3引物溶液、B3引物溶液、BIP引物溶液和FIP引物溶液，其特征在于所述F3引物溶液含核苷酸序列為GCCTCGTCTT CGGTCCAT的 F3引物，所述B3引物溶液含核苷酸序列為CGCCCGTTTC GAAAAGAGG的B3引物，所述BIP引物溶液含核苷酸序列為T(mén)TGAGCGGGG GATGGGAACA CATCGCCAAC TGGTGGTAG 的 BIP 引物，所述 FIP 引物溶液含核苷酸序列為ACTCAGATAG TGGTTCGCGG CGTCTTGACG CCATCGACAA G 的 FIP引物。
2.利用權(quán)利要求I所述的馬動(dòng)脈炎病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑組成的試劑盒，為 100 X 25 μ I反應(yīng)體系的試劑盒，其特征在于該25 μ I反應(yīng)體系的組份包括IOXThermoPol 緩沖液2. 5 μ 1，濃度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1，濃度2. 5mM的dNTP 2 μ 1，濃度5 M的甜菜堿2 μ I，濃度25 mM的MgCl2I μ I，濃度都為10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5 μ I，濃度都為10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ I。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了馬動(dòng)脈炎病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒，包括含核苷酸序列為GCCTCGTCTTCGGTCCAT的F3引物溶液、含核苷酸序列為CGCCCGTTTCGAAAAGAGG的B3引物溶液、含核苷酸序列為T(mén)TGAGCGGGGGATGGGAACACATCGCCAACTGGTGGTAG的BIP引物溶液，含核苷酸序列為ACTCAGATAGTGGTTCGCGGCGTCTTGACGCCATCGACAAG的FIP引物溶液，試劑盒中還有10×ThermoPol緩沖液、BstDNA聚合酶、dNTP、甜菜堿和MgCl2，該RT-LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒對(duì)馬動(dòng)脈炎病毒具有高靈敏度，高特異性，操作簡(jiǎn)單方便，對(duì)儀器要求簡(jiǎn)單，結(jié)果易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；為馬病毒性動(dòng)脈炎的早期防治提供技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102605101SQ201210056298
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者于紀(jì)棉, 倪健波, 張超, 戚亭, 李如松, 楊文潮, 王建峰, 相文華, 章勝喬, 郭巍, 黃素文 申請(qǐng)人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院