專利名稱：一種氧化型輔酶ii的酶催化制備方法
技術領域：
本發明涉及一種氧化型輔酶II的酶催化制備方法。
背景技術：
氧化型輔酶II (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,煙酸胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，簡稱NADP+)是一種極為重要的核苷酸類輔酶，它是氧化型輔酶 I (Nicotinamide adenine dinucleotide,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，簡稱NAD+)中與腺嘌呤相連的核糖環系2’ -位的磷酸化衍生物，是生物氧化過程中不可缺少的氫傳遞體，參與多種合成代謝反應，如脂類、脂肪酸和核苷酸的合成。這些反應中需要NADPH作為還原劑、 氫負供體，NADPH是NADP+的還原形式。NADP+是NAD+通過NAD激酶催化磷酸化所產生。 NAD+和DPNA+是各種不需氧脫氫酶的輔酶，可以接受底物分子上提供的氫負離子0Γ)而還原為NADH和PNADH。植物葉綠體中，光合作用光反應電子鏈的最后一步以NADP+為原料，經鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的催化而產生NADPH。產生的NADPH接下來在)中被用于二氧化碳的同化。對于動物來說，磷酸戊糖途徑的氧化相是細胞中NADPH的主要來源，由它可以產生60%的所需NADPH。目前人類合成NADP+的方法可以分為化學法和生物法。化學法以煙酰胺為原料，經多步反應合成出NADP+，化學法存在反應路線長，反應條件苛刻，選擇性差，易生成副產物，產物純度低，收率低，需用到昂貴的試劑，成本較高等不足；此外，大量有機溶劑的使用還會造成環境污染。因此，該工藝路線不適合于工業化大生產[James Dowden et al, Chemical Synthesis of the Second Messenger Nicotinic Acid Adenine Dinucleotide Phosphate by Total Synthesis of Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, [Angew. Chem. Int. Ed. 2004，43，4637 - 4640]。傳統的生物法是采用發酵或其它微生物培養技術，并通過對酵母或其它微生物的分離提取得到NADP+。該工藝過程雖然已很成熟，但是原料耗費巨大，勞動強度大，能源消耗大，產量有限，生產成本高，產品價格高，限制了氧化型輔酶II (NADP+)的廣泛應用[Sakai, T. , Biotech. Bioeng. 1980, 22, SuppI. I, 143-162; Uchida, T. et al, Agric. Biol. Chem. 1971, 37, 1049-1056; Sakai, T. and Uchida, T. et al, Agric. Biol. Chem. 1973，37，1041-1048]。酶催化轉化是一種高選擇性反應，不同種類的酶可作用于不同構型和不同種類的特定底物，從而達到定向轉化的目的，酶法以其所具有的反應條件溫和、立體專一性強、轉化率高等特點，被廣泛地研究和應用。生物酶法合成NADP+的研究中，Whitesides和其同事構建了聚丙烯酰胺凝膠固定化的NAD焦磷酸化酶和NAD激酶及ATP再生酶催化反應體系，催化煙酰胺核苷磷酸(簡稱NMN)合成NADP+的方法/ Efficient Chemical and Enzymatic Synthesis of Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD+) . J. Am. Chem. SOC., 1984，106，然而，該工藝難于放大，原因在于一是原料合成煙酰胺核苷磷酸合成收率低，且不易放大，原料來源受到限制；二是酶催化合成NAD+和NADP+只能在克級范圍得到高的轉化率，但反應時間長達16天，產能低；三是由于采用固定化的NAD焦磷酸化酶和NAD激酶，煙酰胺核苷磷酸和NAD+與固定化NAD焦磷酸化酶和NAD激酶之間的傳質受到阻礙，影響了固定化NAD焦磷酸化酶和NAD激酶的催化效率，而且該文作者指出該方法未能放大，因此該工藝路線難于適應放大的要求。有必要進一步開發適應于放大生產需要的新工藝。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種易于工業化放大生產的氧化型輔酶II的酶催化制備方法。為解決以上技術問題，本發明采取如下技術方案
一種氧化型輔酶II的酶催化制備方法，其以煙酰胺核苷(NR)和三磷酸腺苷二鈉鹽 (ATP-Na2)為原料，使它們在煙酰胺核苷激酶(NRK)、無機焦磷酸酶、NAD激酶及多聚磷酸激酶四種酶存在下，在PH為4. (Γ8. 5的緩沖溶液中，以及溫度10°C 40°C下進行一鍋煮反應得到氧化型輔酶II。根據本發明，所述緩沖溶液可以為磷酸鹽緩沖溶液、Tri-HCl緩沖溶液或TEA緩沖溶液，緩沖溶液的PH可用無機酸或堿來調節。所述的緩沖溶液的一般濃度為10(T500 mM, 優選為100 200 mM。根據本發明的一個優選方面，所述反應開始時，所述的煙酰胺核苷和三磷酸腺苷二鈉鹽的濃度分別為1(Γ100 mg/ml和2(T200 mg/ml。所述煙酰胺核苷激酶、無機焦磷酸酶、NAD激酶及多聚磷酸激酶的加入量分別為分別為5-50mg酶粉/ml緩沖溶液、IO-IOOmg 酶粉/ml緩沖溶液、5-50mg酶粉/ml緩沖溶液和IO-IOOmg酶粉/ ml緩沖溶液。進一步優選地，所述方法還使所述反應在無機鹽存在下進行，該無機鹽可以為選自鈉、鉀、鎂、鋅、錳、鈷及鐵的金屬的硫酸、鹽酸或磷酸鹽中的一種或多種的混合物，無機鹽的加入量為f 50mg/ml緩沖溶液。無機鹽的具體實例有例如氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈉、二氯化錳、氯化鋅、硫酸鋅等。根據本發明的進一步實施方案所述制備方法的實施過程如下在反應容器中加入緩沖溶液，然后依次加入煙酰胺核苷、三磷酸腺苷二鈉鹽、煙酰胺核苷激酶、無機焦磷酸酶、NAD激酶、多聚磷酸激酶以及無機鹽，控制溫度ΙΟΠΟ ，攪拌反應，利用液相色譜-質譜聯用監測反應的轉化率，至檢測到磷酸腺苷消耗完畢，停止反應。優選地，控制反應在溫度20°C 40°C下進行。在停止反應后，依次經過濾，大孔樹脂吸附，凍干，用乙醇和水的混合溶劑重結晶得到氧化型輔酶II。由于以上技術方案的實施，本發明與現有技術相比具有如下優點
本發明是一種利用微生物酶在溫和條件下高效制備氧化型輔酶II的方法。與已存在的從酵母中分離提取的方法相比，本方法避免了傳統方法的高能耗，高材料消耗和產物價格昂貴等缺點，具備酶催化過程所特有的反應條件溫和、立體專一性強、催化效率高等特點。本發明與現有的酶催化技術相比，原料易于大量得到，用多酶偶聯一鍋法方式進行轉化，簡單有效，反應周期短，產能大，進一步結合等電點結晶和大孔樹脂相結合的方式進行產物分離純化，使得整個工藝成本較低，有利于大批量地工業化制備氧化型輔酶II。
具體實施例方式本發明采用廉價易得的煙酰胺核苷和ATP 二鈉鹽為起始原料，首先通過煙酰胺核苷激酶和無機焦磷酸酶為催化劑，添加金屬離子作為酶活力增強劑，催化煙酰胺核苷和ATP 二鈉鹽偶聯轉化為NAD+ ;然后利用NAD激酶和NAD+合成NADP+，反應中通過加入多聚磷酸激酶促進ATP再生。本發明的特征還在于，為了啟動酶催化反應，使用對煙酰胺核苷和ATP 沒有影響的緩沖溶液，如磷酸鹽緩沖溶液、Tri-HCl緩沖溶液或TEA緩沖溶液中，其中優選磷酸鹽緩沖溶液，酶反應適當地在4. (Γ8. 5，更優選地5. (Γ7. 5 pH值范圍內進行，可用無機酸或堿例如氫氧化鉀調節PH值；合適的反應溫度為1(T60°C，優選溫度是1(T40°C，更優選2(T40°C，特別優選3(T40°C。保溫時間可以根據反應條件來改變，但通常反應時間為30 分鐘 24小時，更優選地f 18小時，可以實現以7(Γ100%的轉化率制備產物氧化型輔酶II。本發明所述的反應以原料和生物酶催化劑同時加入水相反應體系開始酶促催化反應，中間體無需分離純化。停止反應后，可以容易的按照下述的方法回收，例如，反應結束后，反應混合物中的蛋白通過加熱、酸、堿或有機溶劑變性沉淀并通過離心除去。為此目的，可以使用一般用于上清液提取某些產物并適合于氧化型輔酶II各種特性的方法，因此例如，用大孔樹脂純化上清中的氧化型輔酶II，進一步利用等電點特性從用乙醇和水的混合溶劑的混合物中重結晶出氧化型輔酶II。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的說明，但本發明并不限于以下實施例。實施例I
在20 mL三口燒瓶中加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液(100 mM, pH為5. 8)，依次加入煙酰胺核苷 CZ Med. Chem. 2007，50, 6458-6461) 50 mg，三磷酸腺苷二鈉鹽 55 mg，煙酰胺核苷激酶狀2007，5(10)，藝d忍知)8 mg，無機焦磷酸酶(嫩 ，EC 3. 6. I. I) 10 mg, NAD 激酶Journal of Biochemistry, 2001, 268(15), 似mg和多聚磷酸激酶(/WAS； 1997，94(2), 439~442)\2 mg,氯化鎂20 mM， 于37°C下，200 rpm攪拌反應，利用液相色譜-質譜聯用監測反應的轉化率，經過10小時反應后檢測三磷酸腺苷已經消耗完畢，停止反應。通過進一步的過濾，HZ-818型大孔樹脂吸附，凍干，用乙醇和水的混合溶劑(15:1)重結晶即可獲得氧化型輔酶II產品，收率55%。實施例2
在20 mL三口燒瓶中加入10 mL Tris-HCl緩沖溶液(200 mM, pH為7. 5)，依次加入煙酰胺核苷O； Med. Chem. 2007，見，份姑-6必7 ) 50 mg，三磷酸腺苷二鈉鹽55 mg，煙酰胺核苷激酶狀2007，5(10),公激-忍知)12 mg，無機焦磷酸酶(嫩對-似-之 ，EC 3. 6. I. I) 15 mg, NAD 激酶Journal of Biochemistry, 2001, 268(15), 似砂-幻防)12 mg和多聚磷酸激酶(/WAS； 1997，94(2), 439~442)2Q mg,氯化錳30 mM， 氯化鎂20 mM，于37°C下，200 rpm攪拌反應，利用液相色譜-質譜聯用監測反應的轉化率， 經過12小時反應后檢測三磷酸腺苷已經消耗完畢，停止反應。通過進一步的過濾，D-101 型大孔樹脂吸附，凍干，用乙醇和水的混合溶劑(20:1)重結晶即可獲得氧化型輔酶II產品，收率65%。
本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種氧化型輔酶II的酶催化制備方法，其特征在于所述制備方法以煙酰胺核苷和三磷酸腺苷二鈉鹽為原料，使它們在煙酰胺核苷激酶、無機焦磷酸酶、NAD激酶及多聚磷酸激酶四種酶存在下，在PH為4. (Γ8. 5的緩沖溶液中，以及溫度10°C 40°C下進行一鍋煮反應得到氧化型輔酶II。
2.根據權利要求I所述的氧化型輔酶II的酶催化制備方法，其特征在于所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液、Tri-HCl緩沖溶液或TEA緩沖溶液，緩沖溶液的pH用無機酸或堿來調節。
3.根據權利要求I或2所述的氧化型輔酶II的酶催化制備方法，其特征在于所述的緩沖溶液的濃度為100 500 mM。
4.根據權利要求I所述的氧化型輔酶II的酶催化制備方法，其特征在于所述反應開始時，所述的煙酰胺核苷和三磷酸腺苷二鈉鹽的濃度分別為1(T100 mg/ml和2(T200 mg/ ml ο
5.根據權利要求I至4中任一項權利要求所述的氧化型輔酶II的酶催化制備方法， 其特征在于所述煙酰胺核苷激酶、無機焦磷酸酶、NAD激酶及多聚磷酸激酶的加入量分別為5-50mg酶粉/ml緩沖溶液、IO-IOOmg酶粉/ml緩沖溶液、5_50mg酶粉/ ml緩沖溶液和 IO-IOOmg酶粉/ ml緩沖溶液。
6.根據權利要求I所述的氧化型輔酶II的酶催化制備方法，其特征在于所述方法還使所述反應在無機鹽存在下進行，所述無機鹽為選自鈉、鉀、鎂、鋅、錳、鈷及鐵的金屬的硫酸、鹽酸或磷酸鹽中的一種或多種的混合物，所述無機鹽的加入量為l_50mg/ml緩沖溶液。
7.根據權利要求6所述的氧化型輔酶II的酶催化制備方法，其特征在于所述無機鹽為氯化鎂或氯化錳。
8.根據權利要求6或7所述的氧化型輔酶II的酶催化制備方法，其特征在于所述制備方法的實施過程如下在反應容器中加入緩沖溶液，然后依次加入煙酰胺核苷、三磷酸腺苷二鈉鹽、煙酰胺核苷激酶、無機焦磷酸酶、NAD激酶、多聚磷酸激酶以及無機鹽，控制溫度10°C 40°C，攪拌反應，利用液相色譜-質譜聯用監測反應的轉化率，至檢測到磷酸腺苷消耗完畢，停止反應。
9.根據權利要求8所述的氧化型輔酶II的酶催化制備方法，其特征在于所述制備方法的實施過程如下停止反應后，依次經過濾，大孔樹脂吸附，凍干，用乙醇和水的混合溶劑重結晶得到所述氧化型輔酶II。
10.據權利要求8所述的氧化型輔酶II的酶催化制備方法，其特征在于控制反應在溫度20°C 40°C下進行。
全文摘要
本發明涉及一種氧化型輔酶II的酶催化制備方法，其以煙酰胺核苷(NR)和三磷酸腺苷二鈉鹽(ATP-Na2)為原料，使它們在煙酰胺核苷激酶(NRK)、無機焦磷酸酶、NAD激酶及多聚焦磷酸激酶四種酶存在下，在pH為4.0~8.5的緩沖溶液中，以及溫度10℃~40℃下進行一鍋煮反應得到氧化型輔酶II。本發明解決了目前酶催化制備方法中煙酰胺核苷磷酸成本高且不易得到，反應時間長，工藝成本較高，工藝條件也不適合工業放大的技術難題，能夠高效，低成本，且易于工業化放大生產的獲得氧化型輔酶II。
文檔編號C12P19/36GK102605027SQ20121005623
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月6日 優先權日2012年3月6日
發明者劉根, 周永達, 莊季昌, 張超, 李斌, 謝磊, 陶軍華 申請人:蘇州漢酶生物技術有限公司