專利名稱：一種利用黑曲霉水解燈盞乙素制備野黃芩素的方法
技術領域：
本發明屬于天然產物的微生物轉化和提取分離技術領域，特別涉及到利用黑曲霉將燈盞乙素轉化為野黃芩素。
背景技術：
燈蓋花，又名燈蓋細辛，是植物短葶飛蓬(Mrigeron breviscapus (Vant.)Hand-Mazz)的干燥全草，主要分布在云南、廣西等地，味辛、微苦，性溫，具有祛風除濕、溫絡止痛、散寒解表之功效。現代藥理學研究表明，燈盞細辛提取物具有降低血漿粘度、舒張血管、降低血管阻力、抑制缺血后血小板聚集、抗缺血再灌注損傷及改善腦功能等作用(中草 藥，2006，37 (8):附9-附11)，由此引起了人們對燈盞細辛有效成分進行研究的廣泛興趣。經過多年研究，人們從燈盞細辛中分離得到了黃酮類化合物、咖啡酸酯類化合物、氨基酸及多糖類等多種化學成分，并發現燈盞乙素是燈盞花提取物的主要活性成分。研究表明，燈盞乙素還具有抗腫瘤、抗病毒、抗肝纖維化、抗老年癡呆等多種藥理作用。但是，有關燈盞乙素的藥代動力學研究表明，燈盞乙素口服給藥后，燈盞乙素的血藥濃度很低，即生物利用度很低，認為口服幾乎不吸收(中國醫藥工業雜志，2003，34 (12) :618-620)，這極大地制約了其臨床療效的發揮。近年來，有關燈盞乙素的體內代謝研究表明，野黃芩素為燈盞乙素的主要代謝產物(Planta Med 2007, 73: 363-365)，而且，野黃芩素比燈盞乙素具有更高的生物利用度(中國藥學雜志，2007，42 (18) :1418-1421)。因此，野黃芩素的研究、開發與利用受到了人們的關注。當前，僅在少數幾種植物中發現有天然的野黃芩素存在，而且含量極低，因此，試圖從植物中提取獲得大量的野黃芩素是不現實的。為了大量制備野黃芩素，以往通常采用酸性條件下水解燈盞乙素獲得，但酸水解法反應條件不易控制，轉化率低，同時會對環境造成污染，應用范圍受到限制。

發明內容
本發明為了解決現有技術存在的反應條件不易控制、轉化率低、環境污染嚴重等技術問題，提供了一種條件溫和、利于環保、適合工業化生產的制備野黃芩素的方法。本發明的技術解決方案是一種利用黑曲霉水解燈盞乙素制備野黃芩素的方法，利用黑曲霉水解燈盞乙素葡萄糖醛酸基，制備野黃芩素。即利用黑曲霉
niger AS 3. 795)對底物燈盞乙素進行生物轉化，利用乙酸乙酯對發酵液中的轉化產物進行萃取，并利用DlOl大孔吸附樹脂柱色譜和重結晶對轉化產物進行純化。具體步驟如下
a)土豆液體培養基的配制取新鮮土豆，去皮，切成2cm3小塊，加入5倍量水煮沸，保持沸騰狀態30分鐘，用紗布過濾殘渣，濾液加水定容(每200克土豆配制I升培養液)，定容后加入2%葡萄糖。將配好的培養液進行分裝，250mL的錐形瓶可裝入60mL培養液，500mL錐形瓶可裝入200mL培養液。用紗布及牛皮紙將瓶口封好，放入高壓滅菌鍋中滅菌。滅菌條件為115°C滅菌30min。
b)微生物的培養將黑曲霉(Aspergillus niger AS 3. 795)從PDA固體培養基上接種至上述配制好的土豆液體培養基中，置于搖床中于160rpm，26°C條件下培養兩天。
c)加入底物將底物燈盞乙素用適量乙醇溶解，配成5. Omg/mL的乙醇溶液。加入到已培養兩天的微生物發酵液中，在相同條件下繼續培養四天。d)發酵液的處理發酵液抽濾后收集濾液，減壓條件下低溫濃縮至小體積，用等體積乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏。e)轉化產物的分離純化將步驟d)得到的粗浸膏利用DlOl大孔吸附樹脂柱色譜進行分離，分別用50%、60%和95%乙醇水溶液洗脫，得到Q1-UQ1-2和Q1-3三個流分，Q1-2在60%乙醇水溶液中反復重結晶，得到轉化產物野黃芩素。其純度經高效液相色譜檢測達到99%以上。該轉化產物具有以下理化數據yellowamorphous powder ；UV λ MeOH maxnm 281,336 ;FeCl3 顯色呈陽性；ESI-MS m/z :285 [Μ-ΗΓ ; 1H-NMR (DMSO-J6) δ 6. 73 (1Η,s, Η-3), 6. 56 (1Η, s, Η_8)，7.90 (2Η, d, J=8.6 Hz, Η_2’，6’)，6.91 (2Η, d,J=8. 6 Hz, Η-3，，5，)，12.78 (1Η, s, 5-0Η). 13C-NMR(DMSO-J6) δ 163.6(02)，102.4(03)，182.1(04)，147.1(05)，129.2(06)，153.4(07)，93.9(08)，149.7(09)， 104. I (C-IO), 121.6(01，)， 128. 4 (C—2，，6，)， 116. O (C—3，，5，)，161. l(C-4，)。本發明是利用黑曲霉水解燈盞乙素葡萄糖醛酸基，制備野黃芩素。克服了現有技術存在的反應條件不易控制、轉化率低、環境污染嚴重等技術問題，提供了一種條件溫和、利于環保、適合工業化生產的制備野黃芩素的方法。
具體實施例方式本發明可以通過下面兩個實施例比較加以說明。實施例I :通過酸水解法制備野黃芩素(周榮光，野黃芩素的制備、純化與結構表征。光譜實驗室，2011，28 (5) =2402-2406)
稱取燈盞乙素15. Og于IOOOmL圓底燒瓶中，加入IOOmL乙二醇、IOOmL水和IOmL濃鹽酸，于90°C加熱攪拌反應5 h。TLC方法監測反應進程，反應結束后，向反應瓶中加入500mL水，有大量沉淀析出，室溫靜置8 h后，過濾，過濾物水洗至中性，置60°C真空干燥箱中干燥48 h，得野黃芩素粗品7. 3 g。將上述野黃芩素粗品溶于適量甲醇中，用20g硅膠(100-140目)拌樣，通風櫥中揮去溶劑。然后，利用硅膠柱色譜(IOOcmX 4cm;柱床硅膠100g，200-300目)對其進行純化，先后用乙酸乙酯、乙酸乙酯-丙酮(4 1，V/V)洗脫。收集乙酸乙酯-丙酮(4 I, V/V)段洗脫液組分，減壓回收溶劑后，用70%甲醇-水溶液重結晶，得到淺黃色晶體5. Sg,轉化率為62. 5%。其純度經高效液相色譜檢測達到98%。實施例2 :通過黑曲霉制備野黃芩素
a)土豆液體培養基的配制取新鮮土豆2kg,去皮,切成2cm3小塊,加入IOL水煮沸,保持沸騰狀態30分鐘，用紗布過濾殘渣，濾液加水定容至10L，定容后加入200g葡萄糖。將配好的培養液分裝至500mL的錐形瓶中，每瓶裝200mL培養液，大約可分裝50瓶。將上述50瓶培養液用紗布及牛皮紙將瓶口封好，分批放入高壓滅菌鍋中滅菌。滅菌條件為115°C滅.菌 30min。b)微生物的培養將黑曲霉(Aspergillus niger AS 3. 795)從PDA固體培養基上接種至上述配制好的土豆液體培養基中，置于搖床中于160rpm，26°C條件下培養兩天。c)加入底物將Ig燈盞乙素用200mL乙醇溶解，配成5. Omg/mL的乙醇溶液，將該溶液加入到步驟b)所述的發酵液中，每瓶發酵液加入4ml，然后在相同條件下繼續培養四天。d)發酵液的處理發酵液抽濾后收集濾液，減壓條件下低溫濃縮至4-5L，用等體積乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏2. lg。e)轉化產物的分離純化將步驟d)得到的粗浸膏利用DlOl大孔吸附樹脂柱色譜進行分離，分別用50%、60%和95%乙醇水溶液洗脫，得到Q1-UQ1-2和Q1-3三個流分，Q1-2在60%乙醇水溶液中反復重結晶，得到轉化產物野黃芩素480mg，轉化率為77. 5%。其純度經高效液相色譜檢測達到99%以上。
權利要求
1.一種利用黑曲霉水解燈盞乙素制備野黃芩素的方法，其特征在于利用黑曲霉對底物燈盞乙素進行生物轉化，利用乙酸乙酯對發酵液中的轉化產物進行萃取，并利用DlOl大孔吸附樹脂柱色譜和重結晶對轉化產物進行純化。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于轉化產物為(I)所示的野黃芩素
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所制得的轉化產物，其純度可達到99%以上，轉化率為77. 5%。
全文摘要
本發明公開一種利用黑曲霉水解燈盞乙素制備野黃芩素的方法，利用黑曲霉水解燈盞乙素葡萄糖醛酸基，制備野黃芩素。包括如下步驟利用黑曲霉(AspergillusnigerAS3.795)對底物燈盞乙素進行生物轉化，利用乙酸乙酯對發酵液中的轉化產物進行萃取，并利用D101大孔吸附樹脂柱色譜和重結晶對轉化產物進行純化。所制得的轉化產物，其純度根據高效液相色譜檢測可達到99%以上。本發明克服了葡萄糖醛酸苷難以水解的缺點，能夠在常溫、常壓等較為溫和的條件下大量制備野黃芩素，有利于環境保護，降低了生產成本，適合于工業化生產。
文檔編號C12R1/685GK102618593SQ201210060469
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月9日 優先權日2012年3月9日
發明者劉志輝, 康寧, 楊立國, 邱峰, 陳麗霞 申請人:沈陽藥科大學