專利名稱：R-鄰氯扁桃酸及其醇酯的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及ー種鄰氯扁桃酸及其醇酯，特別是涉及ー種R-鄰氯扁桃酸及其醇酯的制備方法。
背景技術：
鄰氯扁桃酸或其醇酯是ー種重要的醫藥、化工中間體。單ー對映體R-鄰氯扁桃酸及其醇酯的制備依賴于三類方法化學法、物理法和生物法。(I)化學法，主要是利用手性胺類化合物，通過形成非對映異構體鹽，得到單ー對映體，也可以利用某種還原試劑以鄰氯苯こ酮酸甲酯不對稱合成單ー構型的扁桃酸甲酷。(2)物理法，用于鄰氯扁桃酸或其醇酯的 對映體拆分，如色譜法、結晶法、膜法和超臨界萃取等方法。無論化學法還是物理法鄰氯扁桃酸或其醇酯對映體的拆分，都不可避免地帶來環保及成本壓力、重金屬殘留等弊端。近年來生物法發展較為迅速，生物法國內外的研究逐年增多，包括野生微生物轉化、基因工程菌轉化、酶法催化及反應介質的選擇等諸多報道。其中，野生微生物轉化主要是以外消旋型鄰氯扁桃酸或其醇酯為底物，通過特定微生物降解某ー對映體，獲得單一光學對映體鄰氯扁桃酸或其醇酷，即便經過菌種改造提高轉化速率，這種方法最大轉化率的理論值僅為50%，轉化率較低，造成資源浪費。國際上，通過定向進化技術獲得的羥氰化酶已應用于R-鄰氯扁桃酸的エ業生產。但由于反應中有劇毒物質HCN的參與，存在極大的安全隱患及環境壓力。采用專一性羰基還原酶還原鄰氯苯こ酮酸甲酷，進而通過分離純化獲得単一的R-鄰氯扁桃酸甲酷，但這種方法需要添加特定的輔因子NADP+ (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，使得反應向還原方向持續進行，成本較高，而且上述方法往往需要調節轉化反應體系，比如常采用兩相催化及離子液體等反應體系，以期獲得更高的產率及光學純度，生產過程較復雜。

發明內容
本發明要解決的技術問題針對現有技術存在的缺陷，提供一種底物廉價易得、理論轉化率高、環境友好、經濟的R-鄰氯扁桃酸及其醇酯的制備方法。本發明的技術方案
本發明提供ー種R-鄰氯扁桃酸及其醇酯制備方法，構建ー種氧化還原偶聯催化體系，該體系包括工程菌培養，誘導表達S-扁桃酸脫氫酶、鄰氯苯こ酮酸羰基還原酶及葡萄糖脫氫酶，直接制備靜息細胞-磷酸鹽緩沖體系，以外消旋型鄰氯扁桃酸(或其醇酷)及葡萄糖為 底物，進行順序催化反應。R-鄰氯扁桃酸的制備方法包括以下步驟
(I)酶的重組表達
設計引物對P1、P2 Pl :5’ -atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2 :5’ -gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3，，以熒光假單胞菌基因組的DNA為PCR模板，進行PCR第一次擴增，擴增產物為S-扁桃酸脫氫酶基因Pf量//ガ，經改造后得到序列為Seql的氨基酸，將序列Seql與表達載體pETDuet-Ι 連接；
設計引物對P3、P4
P3 D> -ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3J,P4 :5，-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’，
以枯草芽孢桿菌基因組的DNA為PCR模板，進行PCR第二次擴增，擴增產物為枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因其氨基酸序列為Seq2N ；
設計引物對P5、P6
P5 :5’ -gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3 ,Pd :5’ -gggccgctcgagttatattctgccct
CSLSLSL^0，
以釀酒酵母基因組的DNA為PCR模板，進行PCR第三次擴增，擴增產物為釀酒酵母羰基還原酶基因6 ,經改造后得到序列為Seq3的氨基酸，將Seq2N、Seq3先后與表達載體pETDuet-Ι 連接；
(2 )轉化宿主制備BL21宿主感受態后，通過熱激法或電擊法獲得能夠表達S-扁桃酸脫氫酶的基因工程菌I及可表達GRE2與Bsmi的基因工程菌13,備用;
(3)接種培養將所述基因工程菌I和基因工程菌]]按菌體密度Γ5:1的比例混合，
共同培養于LB-Amp液體培養基中，于37°C搖床振蕩培養6 10h，轉速240轉/分，當OD6tltl達到O. 4^0. 6時，接種于裝有150mL LB-Amp液體培養基的三角瓶中，三角瓶用紗布封ロ，繼續培養至OD6tltl O. Γ0. 6，將所有培養物接種于裝有IOL LB-Amp液體培養基的種子罐中，培養8h，移種至150L發酵罐中，培養至0D_ O. 4 0. 5，于23°C 26°C、搖床振蕩培養5 8h，轉速220轉/分，至DO值25% 38% ；
(4)外消旋型鄰氯扁桃酸和葡萄糖的添加按照lmol/L的濃度添加外消旋型鄰氯扁桃酸，葡萄糖添加量
為外消旋型扁桃酸的1-1. 5倍，以NADP為輔因子，經過6 10h催化，獲得R-鄰氯扁桃酸。所述的制備方法中第一次、第二次和第三次PCR擴增時PCR體系均為=IOXTaqbuffer 5 μ I ； 10 mmol/L
的 dNTP I. 5 μ I ；25 mmol/L MgCl2 3 μ I ;對應的上下游引物各 I μ I ；DNA 模板 I μ I ;5U/ μ I Taq DNA 聚合
SI 0. 25 μ I ；ddH20 37. 25 μ I。其中第一次PCR擴增時的步驟為(1) 95°C，預變性3min ;(2) 94°C，變性30s;
(3)50°C退火 30s ;(4)
72°C延伸75s ;步驟⑵ (4)重復30次；(5) 72°C繼續延伸lOmin，冷卻至4で。第二次PCR擴增時的步驟為(I) 94°C，預變性3min ;(2) 94°C，變性30s ; (3)54°C退火3Os; (4) 72
で延伸50s ;步驟⑵ ⑷重復30次；(5) 72°C繼續延伸lOmin，冷卻至4°C。第三次PCR擴增時的步驟為(I) 94°C，預變性3min ； (2) 94°C，變性30s ； (3)54°C退火30s ；(4) 72°C延伸66s ;步驟⑵ ⑷重復30次；(5) 72°C繼續延伸lOmin，冷卻至4°C。 本發明的積極有益效果
(I)本發明將廉價易得的外消旋型鄰氯扁桃酸(或其醇酷)生物催化為有重要エ業價值的R-鄰氯扁桃酸(或其醇酷)，這ー順序偶聯反應使得S-鄰氯扁桃酸(或其醇酷)完全轉化為其光學對映體，成本低，綠色環保，エ藝簡化，適于エ業化生產。(2)本發明方法的理論轉化率可達到100%，是ー種環境友好、經濟的R-鄰氯扁桃酸単一光學對映體制備方法，其中S-扁桃酸脫氫酶、羰基還原酶及葡萄糖脫氫酶基因是分離于生物體的天然序列，或經過改造后能夠在相應宿主內獲得活性表達，且S-扁桃酸脫氫酶具有底物S-鄰氯扁桃酸(或其醇酷)專ー性，羰基還原酶具有底物鄰氯苯こ酮酸(或其醇酷)專ー性，以NADP為輔因子，葡萄糖脫氫酶可以氧化葡萄糖且產生適量NADPH，維持催化 反應順序進行。(3)本發明過程精簡，反應時間短，耗能小，易于操作，得率高，產物R-鄰氯扁桃酸(或其醇酷)的得率大于85%，R-鄰氯扁桃酸(或其醇酷)ee值在95%以上。


圖I表示S-扁桃酸脫氫酶基因與表達載體pETDuet-Ι的連接；
圖2表示枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因和釀酒酵母羰基還原酶基因GRE2與表達載體pETDuet-Ι的連接。
具體實施例方式實施例I :R_鄰氯扁桃酸的制備方法，包括以下步驟
(I)酶的重組表達
設計引物對P1、P2
Pl :5’ -atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2 :5’ -gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3，,
以突光假單胞菌iPsGudomorms /Ywore1Scefl1S )的基因組的DNA為PCR模板,進行PCR擴增，PCR 體系為10 X Taq buffer 5μ I ；10 mmol/L dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L MgCl2 3 μ I ;上下游引物各 I μ I ;DNA 模板 I μ I ；5U/ μ I Taq DNA polymerase O. 25 μ I ；ddH20 37. 25 μ I ；PCR 擴增步驟為(1) 95°C，預變性 3min ;(2) 94°C，變性 30s ; (3) 50°C 退火 30s ; (4) 72 °C延伸75s ;重復步驟(2) (4) 30次；(5) 72°C繼續延伸lOmin，冷卻至4で。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收1100-1200bp區間的目標條帶，擴增產物為S-扁桃酸脫氫酶基因PfM//ガ，其核苷酸序列和對應的氨基酸序列分別為SeqlN、SeqlA，SeqlA經改造后得到序列為Seql的氨基酸，將Seql與表達載體pETDuet-Ι連接 '參見圖I。設計引物對P 3、P4:
P3 :5，-ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3J,P4 :5，-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’，
以枯草芽孢桿菌{Bacillus subtil is )基因組的DNA為PCR模板，進行PCR擴增，PCR體系為10XTaq buffer 5 μ I ；10 mmol/L 的 dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L 的 MgCl2 3 μ I ;上下游引物各 I μ I ；DNA 模板 I μ I ；5U/ μ I Taq DNA polymerase O. 25 μ I ；ddH20 37. 25 μ I。PCR擴增步驟為(1) 94°C，預變性 3min ;(2) 94°C，變性 30s ; (3) 54°C退火 30s; (4) 72。。延伸50s ;步驟⑵ ⑷重復30次；(5) 72°C繼續延伸lOmin，冷卻至4°C。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收700-900bp區間的目標條帶，擴增產物為枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因BsGDH，其核苷酸序列和對應的氨基酸序列分別為Seq2N、Seq2A，將 Seq2A 與表達載體 pETDuet-Ι 連接；
設計引物對P 5、P6
P5 :5’ -gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3 ,Pd :5’ -gggccgctcgagttatattctgccct
CSLSLSL^0，
以釀酒酵母i^scchaxomycGS cerevisiae )基因組的DNA為PCR模板，進行PCR擴增，PCR 體系為10XTaq buffer 5μ I ；10 mmol/L 的 dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L 的 MgCl23μ I ;上下游引物各 1μ I ;DNA 模板 1μ I ;5υ/μ I Taq DNA polymerase 0. 25 μ I ；ddH2037. 25 μ I。PCR 擴增步驟為(1) 94°C，預變性 3min ; (2) 94°C，變性 30s ; (3) 54°C退火30s ； (4) 72°C延伸66s ;步驟(2) (4)重復30次；(5) 72°C繼續延伸lOmin，冷卻至4°C。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收1000-1 IOObp區間的目標條帶，擴增產物為釀酒酵母羰基還原酶基因6 ，其核苷酸序列和對應的氨基酸序列分別為Seq3N、Seq3A, Seq3A經改造后得到Seq3氨基酸序列,將Seq3與表達載體pETDuet_l連接；參見圖2。(2)轉化宿主
制備BL21 (DE3)宿主感受態后，通過常規熱激法或電擊法獲得能夠表達S-扁桃酸脫氫
酶的基因工程菌I及可表達GRE2與鳩H的基因工程菌II，備用；
(3)接種培養
將所述的基因工程菌I和基因工程菌 31按菌體密度Γ5:1的比例混合，共同培養于
LB-Amp液體培養基(含50mg/L氨芐青霉素的LB培養基)中，于37°C、搖床振蕩培養6 10h，轉速240轉/分鐘，當OD6tltl達到0. 4^0. 6時，接種于5個裝有150mL LB-Amp液體培養基的三角瓶中，其中三角瓶用八層紗布封ロ，繼續培養至OD6J). 4^0. 6，將所有培養物接種于10L LB-Amp液體培養基的15L種子罐中，培養8小吋，移種至150L發酵罐中，培養至0D_0. 4 0. 5，加入終濃度為 0. 1-0. 6mmol/L (優選 0. 5mmol /L)的 IPTG,于 23°C 26°C、搖床振蕩培養5 8小時，轉速220轉/分，至DO值25% 38% ；
(4)外消旋型鄰氯扁桃酸及葡萄糖的添加按照lmol/L的濃度添加外消旋型鄰氯扁桃酸，葡萄糖添加量為外消旋型扁桃酸的1-1. 5倍，以NADP為輔因子，經過6 10小時催化，獲得R-鄰氯扁桃酸。實施例2 R-鄰氯扁桃酸甲酯的制備方法，和實施例I基本相同，包括以下步驟 將消旋型鄰氯扁桃酸在濃硫酸作用下與甲醇酯化，產生消旋型鄰氯扁桃酸甲酷。以下
步驟與實施例I中的步驟(1)、(2)、(3)、(4)相同，最后獲得R-鄰氯扁桃酸甲酷。其他醇酯的制備只需將酯化的醇變換為相應的醇即可。
權利要求
1.ー種R-鄰氯扁桃酸的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟 (I)酶的重組表達 設計引物對P1、P2 Pl :5’ -atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2 :5’ -gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3，, 以熒光假單胞菌基因組的DNA為PCR模板，進行PCR第一次擴增，擴增產物為S-扁桃酸脫氫酶基因Pf量//ガ，經改造后得到序列為Seql的氨基酸，將序列Seql與表達載體pETDuet-Ι 連接； 設計引物對P3、P4 P3 D> -ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3J,P4 :5，-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’， 以枯草芽孢桿菌基因組的DNA為PCR模板，進行PCR第二次擴增，擴增產物為枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因其氨基酸序列為Seq2N ； 設計引物對P5、P6 P5 :5’ -gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3 ,Pd :5’ -gggccgctcgagttatattctgccctCSLSLSL^0， 以釀酒酵母基因組的DNA為PCR模板，進行PCR第三次擴增，擴增產物為釀酒酵母羰基還原酶基因6 ,經改造后得到序列為Seq3的氨基酸，將Seq2N、Seq3先后與表達載體pETDuet-Ι 連接； (2 )轉化宿主制備BL21宿主感受態后，通過熱激法或電擊法獲得能夠表達S-扁桃酸脫氫酶的基因工程菌I及可表達6 與的基因工程菌 Ii，備用； (3)接種培養將所述基因工程菌I和基因工程菌Il按菌體密度1~5:1的比例混合，共同培養于LB-Amp液體培養基中，于37°C搖床振蕩培養6 10h，轉速240轉/分，當0D_達到O. 4^0. 6時，接種于裝有150mL LB-Amp液體培養基的三角瓶中，三角瓶用紗布封ロ，繼續培養至OD6tltl O. Γ0. 6，將所有培養物接種于裝有IOL LB-Amp液體培養基的種子罐中，培養8h，移種至150L發酵罐中，培養至OD6tltl O. 4 O. 5，于23°C 26°C、搖床振蕩培養5 8h，轉速220轉/分，至DO值25% 38% ； (4)外消旋型鄰氯扁桃酸和葡萄糖的添加按照lmol/L的濃度添加外消旋型鄰氯扁桃酸，葡萄糖添加量 為外消旋型扁桃酸的1-1. 5倍，以NADP為輔因子，經過6 10h催化，獲得R-鄰氯扁桃酸。
2.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于其中第一次、第二次和第三次PCR擴增時PCR體系均為10XTaq buffer 5μ I ；10 mmol/L 的 dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L MgCl2 3 μ I ；對應的上下游引物各I μ I ；DNA模板I μ I ；5U/ μ I Taq DNA聚合酶O. 25 μ I ；ddH2037. 25 μ I ο
3.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于其中第一次PCR擴增時的步驟為(I)95°C，預變性 3min ;(2) 94°C，變性 30s ; (3) 50°C退火 30s ; (4) 72°C延伸 75s;步驟⑵ ⑷重復30 次；(5) 72°C繼續延伸lOmin，冷卻至4で。
4.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于其中第二次PCR擴增時的步驟為(I)94°C，預變性 3min ；⑵94°C，變性30s ； (3) 54°C退火30s ； (4) 72°C延伸50s ;步驟⑵ ⑷重復30次；(5) 72°C繼續延伸lOmin，冷卻至4°C。
5.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于其中第三次PCR擴增時的步驟為(I)94°C，預變性 3min ； (2) 94°C，變性 30s ； (3) 54°C退火 30s ； (4) 72°C延伸 66s ;步驟(2) (4)重復30次；(5) 72°C繼續延伸lOmin，冷卻至4°C。
全文摘要
本發明公開一種R-鄰氯扁桃酸及其醇酯制備方法。本方法通過誘導表達重組S-扁桃酸脫氫酶、羰基還原酶及葡萄糖脫氫酶，以外消旋型鄰氯扁桃酸或其醇酯及葡萄糖為底物，進行順序催化反應，獲得R-鄰氯扁桃酸或其醇酯。采用的基因工程菌為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、假單胞菌及釀酒酵母。該方法是一種環境友好、經濟的R-鄰氯扁桃酸單一光學對映體制備方法，反應時間短，耗能小，易于操作，得率高，產物R-鄰氯扁桃酸(或其醇酯)的得率大于85%，R-鄰氯扁桃酸(或其醇酯)的ee值在95%以上。本發明將廉價易得的外消旋型鄰氯扁桃酸生物催化為具有重要工業價值的R-鄰氯扁桃酸，成本低，綠色環保，工藝簡化，適于工業化生產。
文檔編號C12N15/70GK102660625SQ20121011957
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月23日 優先權日2012年4月23日
發明者吳闊, 王海勇 申請人:鄭州市拓信生物研究所