專利名稱：一種氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶的制備方法
技術領域：
本發明屬于固定蛋白酶領域，特別涉及一種氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶的制備方法。
背景技術：
石墨烯(Graphene)是單原子厚度的碳原子層,近年才被發現的二維碳原子晶體。它被認為是富勒烯、碳納米管(CNT)、石墨的基本結構單元，因其力學、量子和電學性質特殊，頗受物理和材料學界重視。氧化石墨烯(Graphite Oxide,GO)是結晶性高的石墨強力氧化后加水分解得到的化合物，與氟化石墨一樣可以歸類為有共價鍵的石墨層間化合物。一般認為，氧化石墨烯為準二維層狀結構，層間含有大量的羥基和羧基酸性活性基團。其離子交換容量大，長鏈脂肪烴、過渡金屬離子、親水性分子和聚合物等易于通過層間氫鍵、離子鍵和共價鍵等作用插入層間，形成層間化合物。因此可以充分的應用氧化石墨烯的結構和活性基團等性質用于酶的固定化技術。雖然氧化石墨烯在水中具有很好的分散性，并且表面具備大量活性基團，理論上認為可以不用對材料進行修飾而直接進行固載，但實驗證明，用其進行直接的固載效果很差，還是要加入交聯劑(如戊二醛)進行修飾。蛋白酶定義為催化蛋白質中肽鏈水解的酶，廣泛存在于動物內臟、植物莖葉、果實和微生物中，微生物蛋白酶，主要由霉菌、細菌，其次由酵母、放線菌生產。蛋白酶對所作用的反應底物有嚴格的選擇性，一種蛋白酶僅能作用于蛋白質分子中一定的肽鍵，如胰蛋白酶催化水解堿性氨基酸所形成的肽鍵。目前蛋白酶已廣泛應用在皮革、毛皮、絲綢、醫藥、食品、釀造等方面，如皮革工業的脫毛和軟化已大量利用蛋白酶，既節省時間，又改善勞動衛生條件；臨床上可作藥用，如用胃蛋白酶治療消化不良，用酸性蛋白酶治療支氣管炎，用憚性蛋白酶治療脈管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶對外科化膿性創口的凈化及胸腔間漿膜粘連的治療等。為了提高蛋白酶的使用效率，降低生產成本，國內外研究人員對蛋白酶的固定化進行了很多的研究，建立了許多的固定化方法，如用甲殼素或殼聚糖、醋酸纖維素、改性高分子膜等作為固定化載體，采用吸附法或交聯法固定化蛋白酶。而以氧化石墨烯作為固定化酶載體，用交聯-吸附法固定蛋白酶還見相關的報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶的制備方法，該方法工藝簡單，成本低；制得的氧化石墨烯固定化蛋白酶形狀均一，表面具備大量活性基團，分散性良好，表面積大。本發明的一種氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶的制備方法，包括(I)以氧化石墨為原料，用磷酸鹽緩沖液將其溶解，然后磁力攪拌，超聲，靜置過夜，得到氧化石墨烯溶液；(2)在上述氧化石墨烯溶液中加入戊二醛，pH值為7. 0-8.0，于4-37°C下交聯l-12h，離心，之后加入100-1000 μ I堿性蛋白酶，于4-37°C下吸附O. 5_8h，離心，最后經磷酸鹽緩沖液沖洗，制得氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶；其中，戊二醛的加入量為溶液總容量的 O. 1-4%。所述步驟(I)中的氧化石墨與磷酸鹽緩沖液的質量體積比為Ig 1000ml。所述步驟⑴中磁力攪拌的時間為O. 5-3小時，超聲的時間為O. 5-3小時。所述步驟⑴和⑵中磷酸鹽緩沖液的pH值為7. 0-8. O。所述步驟(2)中的離心速度為15000rpm/min，離心時間為10分鐘，離心三次，每次離心完畢加入磷酸鹽緩沖液沖洗。本發明目的在于充分利用氧化石墨烯的性質、拓寬其應用范圍、發掘其作為酶固定化載體的應用潛力、提高蛋白酶的使用效率、降低固定化蛋白酶的生產成本、提高蛋白酶的應用價值及提供一種新型的固定化蛋白酶，即氧化石墨烯固定化蛋白酶。圖I顯示了氧化石墨烯固定化蛋白酶的粒徑范圍；圖2顯示在制備過程中，若恒定其它條件，當每毫克氧化石墨烯的加酶量為500 μ I時，固定化酶的酶活力達86U/mg，固定化酶的酶活力回收率為最高，達68. 5% ；圖3可以看出當吸附時間達到I小時，固定化酶的酶活力與酶活力回收率均達到最大值，分別為115. 4U/mg和92% ；圖4顯示當溫度為25°C時，固定化酶的酶活力與酶活力回收率分別為61. 8U/mg和49. 2%，均達到最大值；圖5顯示當戊二醛溶液的最終濃度為I %時，固定化酶的酶活力與酶活力回收率均達到最大值，分別為67. 02U/mg和53. 4% ;圖6顯示當戊二醛的交聯時間為4小時，固定化酶的酶活力與酶活力回收率均達到最大值，分別為60. OU/mg和47. 8% ;綜上所述,在以上最佳固定化條件下制備氧化石墨烯固定化蛋白酶，其酶活力平均達到70. 4U/mg，酶活力回收率平均達到70. 1% ；圖7顯示氧化石墨烯固定化蛋白酶的表觀米氏常數為Km = 8. 57mg/ml, Vmax =6.10 μ g/min ；圖8顯不氧化石墨稀固定化蛋白酶的最適pH為8 ;圖9顯示氧化石墨烯固定化蛋白酶重復使用3次回收率在40%以上；圖10顯示氧化石墨烯固定化蛋白酶的熱穩定性較游離酶要好。有益效果(I)本發明利用氧化石墨烯這一固定化酶載體的良好特性，特別是形狀均一、在水中具有很好的分散性、表面具備大量活性基團、表面積大、良好的吸附性能等，用交聯-吸附法固定化蛋白酶，從而為發明氧化石墨烯固定化蛋白酶提供良好的前提條件；(2)本發明工藝簡單，成本低；制得的氧化石墨烯固定化蛋白酶形狀均一，表面具備大量活性基團，分散性良好，表面積大；酶活力回收率平均達到70. 1%;與溶液酶相比，固定化酶對底物的親和力提高。


圖I為不同尺寸下氧化石墨烯固定化蛋白酶的電鏡照片(a, 5nm ;b, 50nm)；圖2為加酶量對氧化石墨烯固定堿性蛋白酶效果影響； 圖3為吸附時間對氧化石墨烯固定堿性蛋白酶效果影響；
圖4為溫度對氧化石墨烯固定堿性蛋白酶效果影響；圖5為戊ニ醛濃度對氧化石墨烯固定堿性蛋白酶效果影響；圖6為交聯時間對氧化石墨烯固定堿性蛋白酶效果影響；圖7為氧化石墨烯固定堿性蛋白酶雙倒數曲線；圖8為本發明固定化堿性蛋白酶的pH穩定性；
圖9為本發明固定化堿性蛋白酶的重復實用性；圖10為本發明固定化堿性蛋白酶的熱穩定性。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例I以氧化石墨為原料，用磷酸鹽緩沖液按質量體積比為Ig : IOOOml將其溶解，然后磁力攪拌O. 5小時，超聲3小吋，靜置過夜，直至不分層，得到氧化石墨烯溶液；移液槍準確量取5ml lmg/ml GO溶液，加入400 μ I戊ニ醛(終濃度為I % )，反應溫度25°C下交聯12h,離心(15000rpm/min, IOmin), pH8磷酸鹽緩沖液沖洗三次,加入100 μ I lmg/ml蛋白酶，相同溫度下吸附4h，離心，緩沖液沖洗。上清殘夜收集(采用考馬斯亮蘭法測蛋白濃度)。固載材料4°C冰箱緩沖液中保存。最后測定固定化酶的酶活力與酶活力回收率分別為67. 02U/mg和53. 4%。實施例2以氧化石墨為原料，用磷酸鹽緩沖液按質量體積比為Ig : IOOOml將其溶解，然后磁力攪拌3小時，超聲O. 5小吋，靜置過夜，直至不分層，得到氧化石墨烯溶液；移液槍準確量取5ml lmg/ml GO溶液，加入400 μ I戊ニ醛(終濃度為I % )，反應溫度37°C下交聯12h,離心(15000rpm/min, IOmin), pH8磷酸鹽緩沖液沖洗三次,加入100 μ I lmg/ml蛋白酶，相同溫度下吸附8h，離心，緩沖液沖洗。上清殘夜收集(采用考馬斯亮蘭法測蛋白濃度)。固載材料4°C冰箱緩沖液中保存。最后測定固定化酶的酶活力與酶活力回收率分別為60. OU/mg和47. 8 %。實施例3以氧化石墨為原料，用磷酸鹽緩沖液按質量體積比為Ig : IOOOml將其溶解，然后磁力攪拌2小時，超聲2小吋，靜置過夜，直至不分層，得到氧化石墨烯溶液；移液槍準確量取5ml lmg/ml GO溶液，加入400 μ I戊ニ醛(終濃度為I % )，反應溫度11°C下交聯Ih,離心(15000rpm/min, IOmin), pH8磷酸鹽緩沖液沖洗三次,加入500 μ Ilmg/ml蛋白酶，相同溫度下吸附O. 5h，離心，緩沖液沖洗。上清殘夜收集(采用考馬斯亮蘭法測蛋白濃度)。固載材料4°C冰箱緩沖液中保存。最后測定固定化酶的酶活力與酶活力回收率分別為86U/mg和68. 5%。實施例4以氧化石墨為原料，用磷酸鹽緩沖液按質量體積比為Ig : IOOOml將其溶解，然后磁力攪拌I小時，超聲3小吋，靜置過夜，直至不分層，得到氧化石墨烯溶液； 移液槍準確量取5ml lmg/ml GO溶液，加入400 μ I戊ニ醛(終濃度為I % )，反應溫度25°C下交聯4h,離心(15000rpm/min, I Omin), pH8磷酸鹽緩沖液沖洗三次,加入500 μ Ilmg/ml蛋白酶，相同溫度下吸附lh，離心，緩沖液沖洗。上清殘夜收集(采用考馬斯亮蘭法 測蛋白濃度)。固載材料4°C冰箱緩沖液中保存。最后測定固定化酶的酶活力與酶活力回收率分別為115. 4U/mg和92%。
權利要求
1.一種氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶的制備方法，包括 (1)以氧化石墨為原料，用磷酸鹽緩沖液將其溶解，然后磁力攪拌，超聲，靜置過夜，得到氧化石墨烯溶液； (2)在上述氧化石墨烯溶液中加入戊二醛，pH值為7.0-8. 0，于4-37°C下交聯l_12h，離心，之后加入100-1000 ill堿性蛋白酶，于4-37 °C下吸附0. 5-8h，離心，最后經磷酸鹽緩沖液沖洗，制得氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶；其中，戊二醛的加入量為溶液總容量的0. 1-4%。
2.根據權利要求I所述的一種氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的氧化石墨與磷酸鹽緩沖液的質量體積比為Ig 1000ml。
3.根據權利要求I所述的一種氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中磁力攪拌的時間為0. 5-3小時，超聲的時間為0. 5-3小時。
4.根據權利要求I所述的一種氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶的制備方法，其特征在于所述步驟(I)和(2)中磷酸鹽緩沖液的pH值為7. 0-8. O。
5.根據權利要求I所述的一種氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的離心速度為15000rpm/min，離心時間為10分鐘，離心三次，每次離心完畢加入磷酸鹽緩沖液沖洗。
全文摘要
本發明涉及一種氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶的制備方法，包括(1)以氧化石墨為原料，用磷酸鹽緩沖液將其溶解，然后磁力攪拌，超聲，靜置過夜，得到氧化石墨烯溶液；(2)在上述氧化石墨烯溶液中加入戊二醛，pH值為7.0-8.0，于4-37℃下交聯1-12h，離心，之后加入100-1000μl堿性蛋白酶，于4-37℃下吸附0.5-8h，離心，最后經磷酸鹽緩沖液沖洗，制得氧化石墨烯固定化堿性蛋白酶。本發明工藝簡單，成本低；制得的氧化石墨烯固定化蛋白酶形狀均一，表面具備大量活性基團，分散性良好，表面積大；酶活力回收率平均達到70.1％；與溶液酶相比，固定化酶對底物的親和力提高。
文檔編號C12N11/14GK102660533SQ20121013433
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月2日 優先權日2012年5月2日
發明者孫秀枝, 時鵬輝, 朱少波, 朱振新, 李潔冰, 李登新, 李艷紅, 畢得福, 章文鋒, 蘇瑞景, 譚東棟, 邵先濤, 郭廣麟, 郭苗, 陳明華 申請人:東華大學