專利名稱：一種l-山梨糖/l-山梨酮脫氫酶的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了ー 種L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶基因，尤其是一種全新的L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶基因。
背景技術(shù)：
維生素C，又稱抗壞血酸，作為人體必需的一種維生素和抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于制藥、食品、飲料、化妝品和飼料等エ業(yè)中，2-KLG是合成維生素C的重要前體。最早實現(xiàn)維生素Cエ業(yè)化生產(chǎn)的エ藝是德國Reichstein于1934年發(fā)明的所謂“萊氏法”，包括五步化學(xué)反應(yīng)和一歩生物轉(zhuǎn)化將葡萄糖轉(zhuǎn)化為2-KLG，再經(jīng)酯化生成維生素C。但該法存在能耗高、消耗大量有機溶劑、環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點，與“萊氏法”相比，尹光琳等發(fā)明的ニ步發(fā)酵法具有エ藝流程簡單、生產(chǎn)周期短、成本低廉等優(yōu)點。在這ー過程中，氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)轉(zhuǎn)化D-山梨醇為L-山梨糖，L-山梨糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-KLG的過程是由ー個混菌系統(tǒng)完成的，這ー混菌發(fā)酵系統(tǒng)由巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium,俗稱大菌)和普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare,俗稱小菌)組成,其中K. vulgare為產(chǎn)酸菌,單獨培養(yǎng)時生長微弱，產(chǎn)酸較少；B. megaterium為伴生菌,不產(chǎn)酸,但促進K. vulgare生長或產(chǎn)酸。Ketogulonigeniumsp.是Urbance等人與2001年定義的一個新屬，其分類學(xué)位置為變形菌門(Proteobacteria), α -亞綱(Alpha proteobacteria),紅細菌目(Rhodobacterales),紅細菌科(Rhodobacteraceae)。在變形菌門中，已經(jīng)有954株微生物進行了基因組序列測定。在K. vulgare所在的紅細菌科中已有34株微生物進行了基因組序列測定并公布，主要包括紅細菌屬(8株)、Rueqeria屬(8株)、玫瑰桿菌屬(8株)，這些測序的結(jié)果將會在進化關(guān)系分析及代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中以江蘇江山制藥有限公司提供的維生素Cエ業(yè)生產(chǎn)菌株K. vulgareWSH-OOl為研究対象，利用焦磷酸測序為基礎(chǔ)的454GS FLX高通量測序法結(jié)合傳統(tǒng)的Sanger shotgun測序技術(shù)進行序列測定，得到一種新的同時編碼L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶的雙功能基因，在國內(nèi)外文獻中未見報道，為ー種新的分子。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供ー種L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶基因，可以用來構(gòu)建高產(chǎn)2-KLG的工程菌，簡化維生素C的生產(chǎn)エ藝。所述L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶基因，核苷酸序列如以下I)或2)所示I)其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示核苷酸序列；2)在I)限定的核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶基因編碼的蛋白質(zhì)也是本發(fā)明要求保護的范圍。含有L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶基因的轉(zhuǎn)基因細胞系或基因工程菌也屬于本發(fā)明要求的保護范圍。含有L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶基因的表達載體或克隆載體也屬于本發(fā)明要求的保護范圍。利用本發(fā)發(fā)明提供的基因構(gòu)建基因工程菌的方法為I)根據(jù)本實驗室對K. vulgare WSH-001的全基因組測序結(jié)果中注釋的sdh/sndh序列設(shè)計引物克隆sdh/sndh ；2)將sdh/sndh與pET28a(+)質(zhì)粒連接得到重組表達載體；3)將得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21后得到重組菌株。下面是本發(fā)明技術(shù)方案的具體描述質(zhì)粒及重組菌的構(gòu)建將本實驗室對K. vulgare WSH-001的全基因組測序結(jié)果中注釋的sdh/sndh序列擴增后連接到克隆載體PMD19-T vector上，將構(gòu)建好的克隆載體轉(zhuǎn)化E. coli JM109后對轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR (PCR引物5’ -3’ :GGAATTCCATATGCGACGCGGATTGATG; CCCAAGCTTTTAACCTTCGGGAAGGGC,下同)，驗證陽性轉(zhuǎn)化子(含有1740bp條帶),證明pMD19-T_sdh/sndh已經(jīng)被轉(zhuǎn)化到E. coli中，挑取陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并提取質(zhì)粒測序，將測序正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后回收sdh/sndh片段連接到質(zhì)粒pET28a(+)上構(gòu)建表達載體，將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化E. coli JM109進行菌落PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子(含有1740bp條帶)，證明sdh/sndh基因已經(jīng)連接到pET28a(+)上并被轉(zhuǎn)化到E. coli中；將提取的陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)，得到重組菌E.coli-pET28a_sdh/sndh0重組菌Ε· coli-pET28a-sdh/sndh的誘導(dǎo)表達及酶活測定固體培養(yǎng)基(g/L):酵母膏5，蛋白胨10，氯化鈉10 ;瓊脂20，pH 7. 0，121° C滅菌15min,卡那霉素終濃度50 μ g/mL。LB培養(yǎng)基(g/L):酵母膏5，蛋白胨10，氯化鈉10 ;pH 7.0，121。C滅菌15min。TB培養(yǎng)基蛋白胨12，酵母提取物24，甘油4ml，磷酸ニ氫鉀2. 31，磷酸氫ニ鉀12. 54，pH 7. 0,121。C 滅菌 15min，卡那霉素終濃度 50 μ g/mL，IPTG 終濃度 0. 5mM。培養(yǎng)條件從平板中接種重組菌于25mL的LB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接TB培養(yǎng)基，接種量10%,裝液量10%，誘導(dǎo)前菌體OD6tltl值為0. 6，添加IPTG至終濃度0. 5mM,于30°C、220rpm進行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)時間20h。發(fā)酵結(jié)束后取10D的菌液離心，以0. IM pH7. O的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次菌體，然后加入0. 5mL磷酸鹽緩沖液超聲波破壁處理，將全細胞、破壁上清及破壁沉淀進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。分析山梨糖脫氫酶活性的基本反應(yīng)液由以下組成3ml 0. IM磷酸鉀緩沖液(pH7. 0，含 0. 3% 的 Triton X-100)，0. 45ml 2. 5mM DCIP, 4. 95ml 的蒸餾水，在測量之前準(zhǔn)備好。取0. ImL破壁后粗酶液加入10 μ L的輔酶吡咯喹啉醌(PQQ)30°C孵育lOmin。采用可控溫、可實時監(jiān)測吸光度的分光光度計，用光程0. 5-cm的比色皿，加入以下溶液0. 4ml基本反應(yīng)液，0. Iml濃度為IM的L-山梨糖溶液，混合后30°C預(yù)熱5min，加入經(jīng)孵育后的酶液啟動反應(yīng)。ー個酶活單位定義為Imin內(nèi)I μ mol DCIP被催化還原所需的酶量。DCIP在600nm處的摩爾消光系數(shù)為I. 91 X IO4L. mol'L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶Km值的測定
配制不同濃度的L-山梨糖溶液，分別為O. 0625M、0. 125M、0. 25M、0. 5M、1M，按上述酶活測定的檢測方法，分別求出每個山梨糖濃度下線性范圍內(nèi)的斜率k，按V= (kX60)/I. 91 X IO4 (單位mol.じ1. mirT1)求出反應(yīng)的初速度V,以初速度的倒數(shù)IAi對L-山梨糖的濃度倒數(shù)1/[S]作圖得一直線，求出米氏常數(shù)Km值。 實驗證明此酶促反應(yīng)光吸收-時間曲線前40s基本呈直線關(guān)系，因此試驗中可以通過測定反應(yīng)體系在前40s內(nèi)的平均速度來代替反應(yīng)初速度V。L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶的體外催化作用取50D菌液離心后用pH 7. O磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，再重懸于O. 5mL磷酸鹽緩沖液中超聲波破壁，離心后得到粗酶液，取O. ImL粗酶液，加入IOyL PQQ在30°C下孵育IOmin,再將O. 2mL濃度為IM的L-山梨糖、O. 7mL上述基本反應(yīng)液在30°C下預(yù)熱5min，然后加入酶液立即混勻，30°C保溫15min后用O. lmL50%的三氯こ酸終止酶促反應(yīng)，反應(yīng)液以O(shè). 45 μ m 濾膜過濾后進行液相檢測Agilent IIOOsystem, RioRad 公司 Aminex HPX-87H 色譜柱；流動相2. 75μπκ)1/1濃硫酸;柱溫:35。C ;流速0. 6mL/min ;進樣量5yL ;檢測器示差折光檢測器。山梨醇脫氫酶及山梨酮脫氫酶在維生素Cエ業(yè)化生產(chǎn)中具有重要價值，因此編碼此酶的新的基因的發(fā)現(xiàn)對于維生素C生產(chǎn)エ藝的改進及用于維生素C重組菌的構(gòu)建具有重要的意義與價值。
具體實施例方式實施例I表達載體的構(gòu)建將本實驗室對K. vulgare WSH-001的全基因組測序結(jié)果中注釋的sdh/sndh基因序列擴增后連接到克隆載體PMD19-T vector上，轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)，經(jīng)過抗生素篩選轉(zhuǎn)化子并進行菌落PCR驗證，提取陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒測序，將測序正確的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)HindIII及Nde I雙酶切回收sdh/sndh基因片段連接到同樣經(jīng)HindIII及NdeI雙酶切的pET28a (+)載體上，構(gòu)建表達載體pET28a (+) -sdh/sndh,將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)，經(jīng)抗生素篩選轉(zhuǎn)化子并對轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證，挑取陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)Hind III及Nde I雙酶切后出現(xiàn)1740bp的條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建表達載體pET28a(+)-sdh/sndh ;將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)感受態(tài)，得到重組菌 E.coli-pET28a_sdh/sndh0實施例2L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶的表達及其酶活測定將E. coli-pET28a-sdh/sndh 及對照 E. coli_pET28a 分別接種于 TB 培養(yǎng)基中，一組一直培養(yǎng)至結(jié)束，另ー組當(dāng)OD6tltl達到O. 6時，加入IPTG至終濃度為O. 5mM誘導(dǎo)L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶的表達，培養(yǎng)20h后分別取IOD的菌液12000rpm離心5min，以O(shè). IM pH7. O的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，然后重懸于O. 5mL磷酸鹽緩沖液中超聲波破壁處理20min，將全細胞、破壁上清及破壁沉淀分別進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，與E. coli-pET28a對照，重組菌E. coli-pET28a-sdh/sndh出現(xiàn)一條分子量約為60kD的蛋白條帶。分析山梨糖脫氫酶活性的基本反應(yīng)液由以下組成3ml O. IM磷酸鉀緩沖液(pH
7.0，含 O. 3% 的 Triton X-100)，0. 45ml 2. 5mM DCIP, 4. 95ml 的蒸餾水，在測量之前準(zhǔn)備好。取0. ImL破壁后粗酶液加入IOyL的PQQ在30°C孵育lOmin。采用可控溫、可實時監(jiān)測吸光度的分光光度計，用光程O. 5-cm的比色皿，加入以下溶液0. 4ml基本反應(yīng)液，O. Iml濃度為IM的L-山梨糖溶液,混合后30°C預(yù)熱5min,加入經(jīng)孵育后的酶液啟動反應(yīng),檢測反應(yīng)液在波長600nm處實時的吸光度值，以一定線性范圍時間內(nèi)反應(yīng)液的吸光度變化斜率計算L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶酶活，計算此山梨糖/山梨酮脫氫酶的酶活為4. 8±0. 4/U，一個酶活單位定義為Imin內(nèi)Ιμπιο DCIP被催化還原所需的酶量。DCIP在600nm處的摩爾消光系數(shù)為 I. 91 X IO4L · mol—1。實施例3L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶的米氏常數(shù)Km值的測定分別配制濃度為O. 0625M、0. 125M、0. 25M、0. 5M、1M的L-山梨糖溶液，按上述酶活測定的檢測方法，分別在各個山梨糖的濃度下檢測反應(yīng)液的0D_實時變化值，然后分別求出每個山梨糖濃度下線性范圍內(nèi)的斜率k，按V= (kX60)/1. 91 X IO4(單位mol.じ1. mirT1)求出反應(yīng)的初速度V，以初速度的倒數(shù)IzVi對L-山梨糖的濃度倒數(shù)1/[S]作圖得一直線，求出此山梨糖脫氫酶/山梨酮脫氫酶米氏常數(shù)Km值為O. 35±0. 06mmol/L。實驗證明此酶促反應(yīng)光吸收-時間曲線前40s基本呈直線關(guān)系，因此實驗中可以通過測定反應(yīng)體系在前40s內(nèi)的平均速度來代替反應(yīng)初速度V。實施例4L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶的體外催化作用取50D菌液12000rpm離心5min后以pH 7. O磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，再重懸于O. 5mL磷酸鹽緩沖液中超聲波破壁20min，離心后得到粗酶液，取O. ImL粗酶液，加入10 μ LPQQ在30°C下孵育lOmin，再將O. 2mL濃度為IM的L-山梨糖、O. 7mL上述基本反應(yīng)液在30°C下預(yù)熱5min，然后加入酶液立即混勻，30°C保溫15min后用O. lmL50%的三氯こ酸終止酶促反應(yīng)，反應(yīng)液以O(shè). 45 μ m濾膜過濾后進行液相檢測Agilent IlOOsystem, RioRad公司AminexHPX-87H色譜柱；流動相2. 75 μ mol/L濃硫酸；柱溫35 ° C ;流速0. 6mL/min ;進樣量5 μ L ;檢測器示差折光檢測器。通過液相結(jié)果計算得消耗L-山梨糖1.96±0. 3g ·じ1，2-KLG濃度為1.82±0. 3g.じ1，L-山梨糖的消耗速率為7. 28±0· 5/g(L · h)ベ。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.ー種L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶基因，其特征在于其核苷酸序列如以下I)或2)所示 1)其核苷酸序列為SEQID NO. I所示核苷酸序列； 2)在I)限定的核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶活性的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求I所述基因編碼的蛋白質(zhì)。
3.含有權(quán)利要求I所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。
4.含有權(quán)利要求I所述基因的基因工程菌。
5.含有權(quán)利要求I所述基因的表達載體或克隆載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶基因，該基因具有序列1所示核苷酸序列。其在大腸桿菌表達系統(tǒng)進行了表達，DCIP法檢測表達產(chǎn)物具有酶活性，且具有山梨糖脫氫酶和山梨酮脫氫酶雙功能作用，可用于將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)，并且可與本研究中的L-山梨酮脫氫酶協(xié)同進行由L-山梨糖至2-KLG的轉(zhuǎn)化。
文檔編號C12N9/04GK102676551SQ20121016751
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月26日
發(fā)明者劉杰, 周景文, 堵國成, 陳堅, 高麗麗 申請人:江南大學(xué)