專利名稱：一種縮短煙葉發(fā)酵周期的微生物制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物與煙草加工技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種縮短煙葉發(fā)酵周期的微生物制劑中所含微生物的分離、培養(yǎng)、制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
煙葉發(fā)酵是為卷煙生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)原料的一項(xiàng)重要技術(shù)措施。煙葉發(fā)酵方法可分為自然發(fā)酵法和人工發(fā)酵法。自然發(fā)酵法是把調(diào)制(包括初、復(fù)烤)獲得適當(dāng)水分的煙葉經(jīng)過包裝后存放在倉庫中，利用自然環(huán)境條件，在一定的溫、濕度范圍內(nèi)，利用煙葉內(nèi)酶的活動(dòng)，緩慢地進(jìn)行發(fā)酵，以達(dá)到改善煙葉品質(zhì)的目的。該方法對(duì)煙葉品質(zhì)提高較全面、徹底，是我國目前普遍采用的發(fā)酵方法。但這種方法所用時(shí)間長，通常需要1-2年，不僅占用大量倉庫和資金，而且發(fā)酵 成本高。人工發(fā)酵是將煙葉放在能夠控制溫度和濕度的發(fā)酵室內(nèi)，采用人為的適合煙葉內(nèi)在品質(zhì)變化的條件，促使煙葉化學(xué)成分和物理特性加快變化，從而達(dá)到使煙葉品質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)得到改善得目的。這種方法可大大縮短發(fā)酵時(shí)間，可節(jié)約大量能源，減少資金和倉庫占用，比較經(jīng)濟(jì)。由于微生物發(fā)酵的條件簡單溫和，易于控制，生產(chǎn)成本低，一些微生物具有酶的活性，有的微生物還能產(chǎn)生一些酶，并且產(chǎn)量很高，所以，生物技術(shù)尤其是微生物發(fā)酵技術(shù)在煙草中的應(yīng)用研究逐漸成為煙草科技工作者關(guān)注的課題。1858年英國科學(xué)家Koller最早對(duì)煙草發(fā)酵機(jī)理進(jìn)行研究，指出在某些方面雪茄煙的發(fā)酵與乙醇發(fā)酵相似，并試圖用微生物來提高煙草發(fā)酵效果，20世紀(jì)50年代前蘇聯(lián)科學(xué)家也做了大量微生物煙草發(fā)酵試驗(yàn)，在煙葉發(fā)酵機(jī)理的探索研究和改善煙葉發(fā)酵品質(zhì)等方面取得一定成效，但均未見有成功應(yīng)用的報(bào)道。隨后，前蘇聯(lián)科學(xué)家改變方法用提供酶作用的溫濕度條件創(chuàng)造了人工發(fā)酵方法。我國煙草科技工作者如韓錦峰、邱立友等也嘗試將分離到的優(yōu)勢菌混合制成微生物制劑，噴灑于烤煙煙葉表面，可加速考研發(fā)酵，提高煙葉發(fā)酵品質(zhì)。研究表明，微生物制劑組成對(duì)改善煙葉整體品質(zhì)的影響較大。而現(xiàn)有微生物制劑的作用效果大都較單一，在改善煙葉品質(zhì)、縮短煙葉發(fā)酵周期方面有一定的突破，但較少見成功的工業(yè)應(yīng)用報(bào)道。在煙葉的發(fā)酵過程中，如何有效地利用適宜的微生物和酶制劑來調(diào)控和加速煙葉的內(nèi)在成分向有利于提高卷煙質(zhì)量的方面轉(zhuǎn)化，已成為煙草生物科技工作中的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前，國內(nèi)仍很少采用這種方法，主要是因?yàn)槿狈m宜的人工發(fā)酵劑，發(fā)酵后煙葉品質(zhì)改善效果和自然發(fā)酵有較大差距。與本發(fā)明較為接近的對(duì)比文件是申請(qǐng)?zhí)?01010565687. 5的“一種煙葉烘烤用微生物制劑生產(chǎn)工藝”的專利申請(qǐng)，該申請(qǐng)的目的是提供一種煙葉烘烤用改善煙葉工業(yè)可用性品質(zhì)的微生物制劑生產(chǎn)工藝；技術(shù)方案足使用“純煙葉浸提液固體平板高溫分離煙葉表面微生物的方法”分離的高溫菌菌種，通過一定條件培養(yǎng)獲得發(fā)酵液即為提供煙葉烘烤用的微生物制劑。本發(fā)明的目的與技術(shù)方案與對(duì)比文件相比是有所不同的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠用于改善煙葉品質(zhì)和縮短煙葉發(fā)酵周期的微生物制劑，本發(fā)明的另一個(gè)目的是將該微生物制劑應(yīng)用到煙草發(fā)酵過程中使發(fā)酵后煙葉品質(zhì)與自然醇化煙葉品質(zhì)無明顯差異并縮短傳統(tǒng)的煙葉發(fā)酵周期。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)解決方案實(shí)現(xiàn)的一種縮短煙葉發(fā)酵周期的微生物制劑，主要由臘狀芽孢桿菌Bacillus cereus與解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliqyefaciens構(gòu)成；其活菌數(shù)比例為10 200 I 50 ;該微生物制劑所包含的微生物均分離自煙葉表面，經(jīng)中國普通微生物保藏管理中心鑒定，分別屬于蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus，保藏號(hào)為CGMCC No. 3864和解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliqyefaciens,保藏號(hào)為 CGMCC No. 3866。所述臘狀芽孢桿菌Bacillus cereus與解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliqyefaciens是通過如下方法制備將剪碎的煙葉表面加入已滅菌的LB培養(yǎng)液中，于37°C搖床培養(yǎng)24小時(shí)后，用無菌吸管吸取培養(yǎng)液，采用稀釋涂布法在滅菌固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布，待菌長出后，用接種針在另一滅菌固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線法分離，經(jīng)純化培養(yǎng)后得該單菌落純培養(yǎng)菌。將上述單菌落純培養(yǎng)菌經(jīng)過試管培養(yǎng)基、擴(kuò)大培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后，分別獲得蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌菌液。將上述蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌菌液分別直接離心后得到菌泥，按照活菌數(shù)比例10 200 I 50進(jìn)行混合，按重量百分比加入海藻糖I 2%、甘油I 2. 8%、谷氨酸鈉O. 5 I. 5%作為該菌泥的復(fù)合凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥得到粉末狀微生物制劑。進(jìn)一步地，將上述粉末狀微生物制劑按照O. 5 5%的比例溶于無菌水中，制成微生物制劑水劑，將該水劑以3 10%的比例均勻噴施到煙葉上，將煙葉于25°C 50°C，65%RH 80%RH下人工發(fā)酵10 40天，可獲得與自然醇化煙葉品質(zhì)無明顯差異的人工發(fā)酵后煙葉。更進(jìn)一步地，將該微生物制劑用于煙葉發(fā)酵過程，具有改善煙葉品質(zhì)、縮短煙葉發(fā)酵周期的作用。本發(fā)明微生物制劑具有以下性質(zhì)該微生物制劑所含微生物為(1)蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus，其保藏登記號(hào)為CGMCC No. 3864。細(xì)胞桿狀，革蘭氏陽性，形成芽孢，孢囊不膨大。在LB培養(yǎng)基上的菌落為圓形、邊緣整齊、白色，有光澤。VP反應(yīng)陽性，VP液pH〈6，營兼性厭氧生活。接觸酶陽性。甲基紅試驗(yàn)陽性。從葡萄糖產(chǎn)酸。在pH5. 7和7%NaCl中生長。分解酵素和淀粉。還原硝酸鹽。(2)解淀粉芽孢桿菌Bacillus cereus，其保藏登記號(hào)為CGMCC No. 3866。細(xì)胞桿狀，革蘭氏陽性，形成芽孢，孢囊不膨大。在LB培養(yǎng)基上的菌落為圓形、邊緣整齊、白色、半透明，光滑濕潤，稍隆起。VP反應(yīng)陽性，VP液pH〈6，營兼性厭氧生活。接觸酶陽性。甲基紅試驗(yàn)陰性。利用多種碳水化合物產(chǎn)酸。在pH5. 7和7%NaCl中生長。分解酵素和淀粉。還原硝酸鹽。
試驗(yàn)表明，本發(fā)明微生物制劑用于煙草發(fā)酵過程中，能有效降解煙草中的纖維素、蛋白質(zhì)和果膠等，其中果膠降解率可達(dá)40%左右，蛋白質(zhì)降解率可達(dá)到23%左右，纖維素降解率可分別達(dá)到12%左右，并使煙葉刺激性降低、青雜氣減少，吸味改善，發(fā)酵后煙葉品質(zhì)與自然醇化煙葉品質(zhì)無明顯差異，可將煙葉發(fā)酵周期縮短至10 40天，具有突出的優(yōu)點(diǎn)與顯著的有益效果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用分離自煙葉本身有益微生物的方法而得到的微生物制劑。該制劑主要由臘狀芽抱桿菌Bacillus cereus與解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliqyefaciens兩種菌株構(gòu)成；其活菌數(shù)比例為10 200 I 50 ;該微生物制劑所包含的微生物均分離自煙葉表面，經(jīng)中國普通微生物保藏管理中心鑒定，分別屬于蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus,保藏號(hào)為CGMCC No. 3864和解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliqyefaciens,保藏號(hào)為CGMCC No. 3866。所述微生物制劑所含微生物的分離，在于將剪碎的煙葉表面加入已滅菌的LB培養(yǎng)液中，于37°C搖床培養(yǎng)24小時(shí)后，用無菌吸管吸取培養(yǎng)液，采用稀釋涂布法在滅菌固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布，待菌長出后，用接種針在另一同樣滅菌固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線法分離，經(jīng)純化培養(yǎng)后得該單菌落純培養(yǎng)菌。將上述單菌落純培養(yǎng)菌經(jīng)過試管培養(yǎng)基、擴(kuò)大培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)以后，分別獲得蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌菌液，具體按照以下步驟進(jìn)行(I)試管培養(yǎng)基采用滅菌固體LB培養(yǎng)基，將蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌分別接種到試管培養(yǎng)基上，接種后35-38°C下活化培養(yǎng)24小時(shí)；(2)擴(kuò)大培養(yǎng)基采用滅菌液體LB培養(yǎng)基，將試管培養(yǎng)基中蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌分別接種在錐形瓶中，置于搖床上37°C，振蕩培養(yǎng)24 48小時(shí)，作為種子液；(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中采用液體LB培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘左右，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至36°C時(shí)，將錐形瓶中的培養(yǎng)物按5-10%的比例接種發(fā)酵液，36 38°C培養(yǎng)48小時(shí)，可分別得到蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌菌液。將上述蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌菌液分別直接離心后得到菌泥，按照活菌數(shù)比例10 200 I 50進(jìn)行混合，按重量百分比加入海藻糖I 2%、甘油I 2. 8%、谷氨酸鈉O. 5 I. 5%作為該菌泥的復(fù)合凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥得到粉末狀微生物制劑。該微生物制劑應(yīng)用于煙草發(fā)酵過程是按照O. 5 5%的比例，將粉末狀微生物制劑溶于無菌水中，制成微生物制劑水劑。將該水劑以3 10%的比例均勻噴施到煙葉上，于25°C 50°C，65%RH 80%RH下人工發(fā)酵10天 40天，具有改善煙葉品質(zhì)、縮短煙葉發(fā)酵周期的作用。下述實(shí)施例將具體說明本發(fā)明。然而，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，這些實(shí)施例只是用來描述本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范疇。實(shí)施例I :將蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌菌泥，按照活菌數(shù)比例4 I進(jìn)行混合，按重量百分比加入海藻糖I. 2%、甘油I. 8%、谷氨酸鈉I. 0%作為該菌泥的復(fù)合凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥得到粉末狀微生物制劑。按照1%的比例將該粉末狀微生物制劑溶于無菌水中，充分?jǐn)嚢韬螅【鷦㊣OKg均勻噴霧添加到IOOkg煙葉上，于45°C、80%RH條件下人工發(fā)酵22天，可達(dá)到發(fā)明內(nèi)容所述的效果。添加本發(fā)明所述微生物制劑人工發(fā)酵22天后的煙葉(添加樣)與未發(fā)酵煙葉(原始樣)相比，其蛋白質(zhì)含量明顯降低；添加樣刺激性降低、青雜氣減少，特征香氣明顯，吸味改善，與自然發(fā)酵60天的同一品種煙葉(對(duì)照樣)品質(zhì)相當(dāng)，其化學(xué)成分及感官質(zhì)量檢測結(jié)果如下表一化學(xué)成分檢測結(jié)果
職舶質(zhì)(%)淀粉(%) (%，以‘酸計(jì))幌㈤
權(quán)利要求
1.一種縮短煙葉發(fā)酵周期的微生物制劑，其特征在于，主要由蠟狀芽孢桿菌cereus與解淀粉芽孢桿菌BaciIlus amyloliqyefaciens構(gòu)成，其活菌數(shù)比例為IO 200:1 50 ;該微生物制劑所包含的微生物均分離自煙葉表面，經(jīng)中國普通微生物保藏管理中心鑒定,分別屬于臘狀芽孢桿菌cereus■，保藏號(hào)為CGMCC No. 3864和解淀粉芽抱桿菌 AaciJJw1S amyloli qyefaci ens,保藏號(hào)為 CGMCC No. 3866。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種縮短煙葉發(fā)酵周期的微生物制劑，特征在于，所述的蠟狀芽抱桿菌cereus與解淀粉芽抱桿菌amyloli qyefaci ens是通過如下方法制備將剪碎的煙葉表面加入已滅菌的LB培養(yǎng)液中，于37°C搖床培養(yǎng)24小時(shí)后，用無菌吸管吸取培養(yǎng)液，采用稀釋涂布法在滅菌固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布，待菌長出后，用接種針在另一滅菌固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線法分離，經(jīng)純化培養(yǎng)后得該單菌落純培養(yǎng)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種縮短煙葉發(fā)酵周期的微生物制劑的制備，其特征在于，將上述單菌落純培養(yǎng)菌經(jīng)過試管培養(yǎng)基、擴(kuò)大培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后，分別獲得蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌菌液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種縮短煙葉發(fā)酵周期的微生物制劑的制備，其特征在于，將上述蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌菌液分別直接離心后得到菌泥，按照活菌數(shù)比例10 200:1 50進(jìn)行混合，按重量百分比加入海藻糖I 2%、甘油I 2. 8%、谷氨酸鈉0.5 I. 5%作為該菌泥的復(fù)合凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥得到粉末狀微生物制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種縮短煙葉發(fā)酵周期的微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于，將上述粉末狀微生物制劑按照0. 5 5%的比例溶于無菌水中，制成微生物制水劑，將該水劑以3 10%的比例均勻噴施到煙葉上，將煙葉于25°C 50°C，65% RH 80% RH下人工發(fā)酵10 40天，可獲得與自然醇化煙葉品質(zhì)無明顯差異的人工發(fā)酵后煙葉。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種縮短煙葉發(fā)酵周期的微生物制劑的應(yīng)用，其特征在于，將該微生物制劑用于煙葉發(fā)酵過程，具有改善煙葉品質(zhì)、縮短煙葉發(fā)酵周期的作用。
全文摘要
一種縮短煙葉發(fā)酵周期的微生物制劑及其應(yīng)用，涉及微生物與煙草加工技術(shù)領(lǐng)域。該微生物制劑包含分離自煙葉本身的蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩株細(xì)菌，其活菌數(shù)比例為10～200:1～50。經(jīng)過分離、培養(yǎng)、制備獲得粉末狀微生物制劑；將粉末狀微生物制劑以0.5～5%的比例溶于無菌水中，將形成的水劑以3～10%的比例均勻噴施到煙葉上，置于25℃～50℃，65%RH～80%RH下人工發(fā)酵10～40天。試驗(yàn)表明，能有效降解煙草中的纖維素、蛋白質(zhì)和果膠等，將煙葉發(fā)酵周期縮短至10～40天。獲得與自然醇化煙葉品質(zhì)無明顯差異的人工發(fā)酵后煙葉，具有縮短煙葉發(fā)酵周期并可改善煙葉品質(zhì)的作用。
文檔編號(hào)C12N1/00GK102660461SQ201210167608
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者吳艷, 寇明鈺, 戴亞, 曾代龍, 李寧, 汪長國, 賈玉紅 申請(qǐng)人:川渝中煙工業(yè)有限責(zé)任公司