專利名稱：一種新的l-山梨酮脫氫酶的基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明公開了ー種新L-山梨酮脫氫酶基因及其編碼蛋白質，特別是ー種全新的L-山梨酮脫氫酶基因。
背景技術：
維生素C，又稱抗壞血酸，作為人體必需的一種維生素和抗氧化劑，廣泛應用于制 藥、食品、飲料、化妝品和飼料等エ業中，2-KLG是合成維生素C的重要前體。最早實現維生素Cエ業化生產的エ藝是德國Reichstein于1934年發明的所謂“萊氏法”，包括五步化學反應和一歩生物轉化將葡萄糖轉化為2-KLG，再經酯化生成維生素C。但該法存在能耗高、消耗大量有機溶劑、環境污染嚴重等缺點，與“萊氏法”相比，尹光琳等發明的ニ步發酵法具有エ藝流程簡單、生產周期短、成本低廉等優點。在這ー過程中，氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)轉化D-山梨醇為L-山梨糖，L-山梨糖轉變為2-KLG的過程是由ー個混菌系統完成的，這ー混菌發酵系統由巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium,俗稱大菌)和普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare,俗稱小菌)組成,其中K. vulgare為產酸菌,單獨培養時生長微弱，產酸較少；B. megaterium為伴生菌,不產酸,但促進K. vulgare生長或產酸。Ketogulonigenium sp.是Urbance等人與2001年定義的一個新屬，其分類學位置為變形菌門(Proteobacteria), α -亞綱(Alpha proteobacteria),紅細菌目(Rhodobacterales),紅細菌科(Rhodobacteraceae)。在變形菌門中，已經有954株微生物進行了基因組序列測定。在K. vulgare所在的紅細菌科中已有34株微生物進行了基因組序列測定并公布，主要包括紅細菌屬(8株)、Rueqeria屬(8株)、玫瑰桿菌屬(8株)，這些測序的結果將會在進化關系分析及代謝網絡構建中發揮重要作用。

發明內容
本發明中以江蘇江山制藥有限公司提供的維生素Cエ業生產菌株K. vulgareWSH-OOl為研究対象，利用焦磷酸測序為基礎的454GS FLX高通量測序法結合傳統的Sanger shotgun測序技術進行序列測定，得到一種新的山梨酮脫氫酶基因，在國內外文獻中未見報道，為一種新的分子。本發明要解決的技術問題是提供ー種L-山梨酮脫氫酶基因，可以用來構建高產2-KLG的工程菌，簡化維生素C的生產エ藝。所述L-山梨酮脫氫酶基因，核苷酸序列如以下I)或2)所示I)其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示核苷酸序列；2)在I)限定的核苷酸序列基礎上經堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具L-山梨酮脫氫酶基因編碼的蛋白質也是本發明要求保護的范圍。含有L-山梨酮脫氫酶基因的轉基因細胞系或基因工程菌也屬于本發明要求的保護范圍。含有L-山梨酮脫氫酶基因的表達載體或克隆載體也屬于本發明要求的保護范圍。利用本發發明提供的基因構建基因工程菌的方法為I)根據本實驗室對K. vulgare WSH-001的全基因組測序結果中注釋的sndh序列設計引物克隆sndh ；2)將sndh與pET28a(+)質粒連接得到重組表達載體；3)將得到的重組表達載體轉化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21后得到重組菌
株。 下面是本發明技術方案的具體描述質粒及重組菌的構建將本實驗室對K. vulgare WSH-001的全基因組測序結果中注釋的sndh序列擴增后連接到克隆載體PMD19-T vector上，將構建好的克隆載體轉化E. coli JM109后對轉化子進行菌落 PCR (PCR 引物 5’ -3’ : GGAATTCCATATGAGCGTTCTGGCCAAATTCACTTC;CCCAAGCTTTTACGCAGCGGAAATCCGCC,下同)，驗證陽性轉化子(含有 1290bp 條帶)，證明pMD19-T-sndh已經被轉化到E. coli中，挑取陽性轉化子培養并提取質粒測序，將測序正確的轉化子提取質粒，經雙酶切后回收sndh片段連接到質粒pET28a(+)上構建表達載體，將構建好的表達載體轉化E. coli JM109進行菌落PCR驗證陽性轉化子(含有1290bp條帯)，證明sndh基因已經連接到pET28a(+)上并被轉化到E. coli中；將提取的陽性轉化子質粒轉化 E. coli BL21 (DE3)，得到重組菌 E. coli-pET28a_sndh。重組菌Ε· coli-pET28a-sdh/sndh的誘導表達及酶活測定固體培養基(g/L):酵母膏5，蛋白胨10，氯化鈉10 ;瓊脂20，pH 7. 0，121° C滅菌15min,卡那霉素終濃度50 μ g/mL。LB培養基(g/L):酵母膏5，蛋白胨10，氯化鈉10 ;pH 7.0,121° C滅菌15min。TB培養基蛋白胨12，酵母提取物24，甘油4ml，磷酸ニ氫鉀2. 31，磷酸氫ニ鉀12. 54，pH 7. 0,121。C 滅菌 15min，卡那霉素終濃度 50 μ g/mL，IPTG 終濃度 O. 5mM。培養條件從平板中接種重組菌于25mL的LB培養基中，轉接TB培養基，接種量10%,裝液量10%，誘導前菌體OD6tltl值為O. 6，添加IPTG至終濃度O. 5mM,于30°C、220rpm進行搖瓶培養，培養時間20h。發酵結束后取IOD的菌液離心，以O. IM pH7. O的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次菌體，然后加入O. 5mL磷酸鹽緩沖液超聲波破壁處理，將全細胞、破壁上清及破壁沉淀進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。分析山梨酮脫氫酶活性的基本反應液由以下組成3ml O. IM磷酸鉀緩沖液(pH7. 0，含 O. 3% 的 Triton X-100)，0. 45ml 2. 5mM DCIP，4. 95ml 的蒸餾水，在測量之前準備好。取0. ImL破壁后粗酶液加入10 μ L的輔酶吡咯喹啉醌(PQQ)30°C孵育lOmin。采用可控溫、可實時監測吸光度的分光光度計，用光程0. 5-cm的比色皿，加入以下溶液0. 4ml基本反應液，0. Iml濃度為IM的こニ醛溶液(因為山梨酮不穩定，根據文獻采用こニ醛代替)，混合后30°C預熱5min，加入經孵育后的酶液啟動反應。一個酶活単位定義為Imin內Iumol DCIP被催化還原所需的酶量。DCIP在600nm處的摩爾消光系數為I. 91 X IO4L.mo I οL-山梨酮脫氫酶Km值的測定
配制不同濃度的こニ醛溶液，分別為O. 0625M、0. 125M、0. 25M、0. 5M、1M，按上述酶活測定的檢測方法，分別求出每個こニ醛濃度下線性范圍內的斜率k，按V= (kX60)/I. 91 X 104(單位mol.じ1. mirT1)求出反應的初速度V,以初速度的倒數IVvi對こニ醒的濃度倒數1/[S]作圖得一直線，求出米氏常數Km值。實驗證明此酶促反應光吸收-時間曲線前40s基本呈直線關系，因此試驗中可以通過測定反應體系在前40s內的平均速度來代替反應初速度V。L-山梨酮脫氫酶的體外催化作用取50D菌液離心后用pH 7. O磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，再重懸于O. 5mL磷酸鹽緩沖液中超聲波破壁，離心后得到粗酶液，各取O. ImL L-山梨糖/山梨酮脫氫酶(本研究中發現)和L-山梨酮脫氫酶的粗酶液混勻，加入10 μ L PQQ在30°C下孵育lOmin，再將O. 2mL濃度為IM的L-山梨糖、O. 7mL上述基本反應液在30°C下預熱5min，然后加入酶液立即混 勻，30°C保溫15min后用O. lmL50%的三氯こ酸終止酶促反應，反應液以O. 45 μ m濾膜過濾后進行液相檢測Agilent IlOOsystem, RioRad公司Aminex HPX-87H色譜柱；流動相2. 75 μ mo I/L濃硫酸；柱溫35° C ;流速0. 6mL/min ;進樣量5 μ L ;檢測器示差折光檢測器。山梨糖脫氫酶及山梨酮脫氫酶在維生素Cエ業化生產中具有重要價值，因此編碼此酶的新的基因的發現對于維生素C生產エ藝的改進及用于維生素C重組菌的構建具有重要的意義與價值。
具體實施例方式實施例I表達載體的構建將本實驗室對K. vulgare WSH-001的全基因組測序結果中注釋的sndh基因序列擴增后連接到克隆載體PMD19-T vector上，轉化E. coli JM109感受態，經過抗生素篩選轉化子并進行菌落PCR驗證，提取陽性轉化子質粒測序，將測序正確的轉化子培養后提取質粒，經Hind III及Nde I雙酶切回收sndh基因片段連接到同樣經Hind III及Nde
I雙酶切的pET28a(+)載體上，構建表達載體pET28a(+)-sndh，將構建好的表達載體轉化E. coli JM109感受態，經抗生素篩選轉化子并對轉化子進行菌落PCR驗證，挑取陽性轉化子培養后提取質粒，經Hind III及Nde I雙酶切后出現1290bp的條帶，證明已經成功構建表達載體pET28a(+)-sndh;將提取的質粒轉化E. coli BL21(DE3)感受態，得到重組菌E.coli-pET28a_sndh0實施例2L-山梨酮脫氫酶的表達及其酶活測定將E. coli-pET28a-sndh及對照E. coli_pET28a分別接種于TB培養基中，ー組ー直培養至結束，另ー組當0D_達到0. 6時，加入IPTG至終濃度為0. 5mM誘導L-山梨酮脫氫酶的表達，培養20h后分別取10D的菌液12000rpm離心5min，以0. IM pH7. O的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，然后重懸于0. 5mL磷酸鹽緩沖液中超聲波破壁處理20min，將全細胞、破壁上清及破壁沉淀分別進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，與E. coli-pET28a對照，重組菌E. coli-pET28a-sndh出現一條分子量約為43kD的蛋白條帶。分析山梨酮脫氫酶活性的基本反應液由以下組成3ml 0. IM磷酸鉀緩沖液(pH7. 0，含 0. 3% 的 Triton X-100)，0. 45ml 2. 5mM DCIP, 4. 95ml 的蒸餾水，在測量之前準備好。取O. ImL破壁后粗酶液加入IOyL的PQQ在30°C孵育lOmin。采用可控溫、可實時監測吸光度的分光光度計，用光程O. 5-cm的比色皿，加入以下溶液0. 4ml基本反應液，O. Iml濃度為IM的こニ醒溶液,混合后30°C預熱5min,加入經孵育后的酶液啟動反應,檢測反應液在波長600nm處實時的吸光度值，以一定線性范圍時間內反應液的吸光度變化斜率計算L-山梨酮脫氫酶酶活，計算此山梨酮脫氫酶的酶活為226. 8±7. 4U，一個酶活単位定義為Imin內Ιμπιο DCIP被催化還原所需的酶量。DCIP在600nm處的摩爾消光系數為I. 91 X IO4L.mo I ο實施例3L-山梨酮脫氫酶的米氏常數Km值的測定
分別配制濃度為O. 0625M、0. 125M、0. 25M、0. 5M、1M的こニ醛溶液，按上述酶活測定的檢測方法，分別在各個こニ醛的濃度下檢測反應液的OD6tltl實時變化值，然后分別求出每個こニ醛濃度下線性范圍內的斜率k，按V= (kX60)/1. 91 XlO4(單位mol.じ1. mirT1)求出反應的初速度V，以初速度的倒數Ι/Vi對こニ醛的濃度倒數1/[S]作圖得一直線，求出此山梨酮脫氫酶米氏常數Km值為O. 09±0. Olmol/L。實驗證明此酶促反應光吸收-時間曲線前40s基本呈直線關系，因此實驗中可以通過測定反應體系在前40s內的平均速度來代替反應初速度V。實施例4L-山梨酮脫氫酶的體外催化作用取50D菌液12000rpm離心5min后以pH 7. O磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，再重懸于0. 5mL磷酸鹽緩沖液中超聲波破壁20min，離心后得到粗酶液，各取0. ImL L-山梨糖/山梨酮脫氫酶(KVU 0203，本研究中發現)和L-山梨酮脫氫酶的粗酶液混勻，加入10 μ L PQQ在30°C下孵育lOmin，再將0. ImL濃度為IM的こニ醛、0. 4mL上述基本反應液在30°C下預熱5min，然后加入酶液立即混勻，30°C保溫15min后用0. lmL50%的三氯こ酸終止酶促反應，反應液以0. 45 μ m濾膜過濾后進行液相檢測Agilent IlOOsystem, RioRad公司AminexHPX-87H色譜柱；流動相2. 75ymol/L濃硫酸；柱溫:35。C ;流速0. 6mL/min ;進樣量5μ L ;檢測器示差折光檢測器。通過液相結果計算得消耗L-山梨糖4. 19±0. 2g.じ1，2-KLG濃度為3. 89±0. Ig.じ1，L-山梨糖的消耗速率為15.6±0. 6/g(L. h)—1，分別比L-山梨糖/山梨酮脫氫酶單獨作用高出12. 0%、12. 1%，12. 3%。雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
權利要求
1.一種新的L-山梨酮脫氫酶基因，其特征在于其核苷酸序列如以下I)或2)所示 1)其核苷酸序列為SEQID NO. I所示核苷酸序列； 2)在I)限定的核苷酸序列基礎上經堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有L-山梨酮脫氫酶活性的核苷酸序列。
2.權利要求I所述基因編碼的蛋白質。
3.含有權利要求I所述基因的轉基因細胞系。
4.含有權利要求I所述基因的基因工程菌。
5.含有權利要求I所述基因的表達載體或克隆載體。
全文摘要
本發明公開了一種新的L-山梨酮脫氫酶基因，該基因具有序列1所示核苷酸序列。其在大腸桿菌表達系統進行了表達，DCIP法檢測表達產物具有酶活性，且具有山梨糖脫氫酶和山梨酮脫氫酶雙功能作用，可用于將L-山梨糖轉化為2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)，并且可與本研究中的L-山梨酮脫氫酶協同進行由L-山梨糖至2-KLG的轉化。
文檔編號C12N1/19GK102676552SQ20121016855
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月25日 優先權日2012年5月25日
發明者劉杰, 周景文, 堵國成, 陳堅, 高麗麗 申請人:江南大學