專利名稱：一種縮短植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)周期的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
·細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是生產(chǎn)植物次生代謝物的重要手段之一。但是，植物懸浮細(xì)胞生長速度緩慢、培養(yǎng)周期長成了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的環(huán)節(jié)多、成本高等關(guān)鍵問題。本發(fā)明利用RNAi原理，通過降低植物p53基因的表達(dá)，以達(dá)到縮短植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)周期、提高細(xì)胞培養(yǎng)密度目的。

發(fā)明內(nèi)容
構(gòu)建植物細(xì)胞表達(dá)載體。通過比對Genbank注冊的植物p53基因的核苷酸序列，選定其兩個保守區(qū)各30-100個堿基對的核苷酸序列分別為正向片段I和II，并以其為依據(jù)分別設(shè)置其對應(yīng)的反向序列(I’和II’ );根據(jù)兩對正、反序列設(shè)計(jì)出合適的引物，在PCR擴(kuò)增過程中，使正反片段分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(EcoR I和Hind III)和相應(yīng)的⑶-AG內(nèi)含子端部序列。經(jīng)過酶切、再連接、轉(zhuǎn)化、克隆和鑒定后，得到了四片段的I-AC-II’ -II-CT-I’序列產(chǎn)物；該產(chǎn)物插入到PCAMBIA2300植物表達(dá)載體，導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105，篩選出能轉(zhuǎn)化植物的工程菌。以甘草為例獲得甘草轉(zhuǎn)化體。從甘草幼苗的上胚軸上誘導(dǎo)愈傷組織；早期愈傷組織與農(nóng)桿菌工程菌共培養(yǎng)；隨后在含抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，篩選出抗性愈傷組織并進(jìn)行繼代培養(yǎng)；將松散的抗性愈傷組織在液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)物過篩后繼續(xù)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞。高產(chǎn)懸浮細(xì)胞系的篩選。利用看護(hù)培養(yǎng)手段，從懸浮細(xì)胞中篩選生長速度快的單細(xì)胞系愈傷組織；將該愈傷組織在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)物過篩后繼續(xù)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得由單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)組成的懸浮系；對該懸浮系的細(xì)胞生長周期、主要代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行等鑒定并穩(wěn)定性試驗(yàn)，獲得的生長懸浮細(xì)胞作為種子進(jìn)入大規(guī)模。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化。通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得植物細(xì)胞生長和產(chǎn)物積累的最適碳氮源、pH、溫度、溶氧量和最佳接種量等發(fā)酵工藝參數(shù)，為進(jìn)一步進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供了依據(jù)。主要用途利用本發(fā)明方法獲得的培養(yǎng)周期短、成本低、生產(chǎn)效率高的細(xì)胞，將在大規(guī)模開發(fā)和生產(chǎn)藥用植物有效成分方面將發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
具體實(shí)施例方式以甘草為例-干涉p53基因制備生長周期短的細(xì)胞懸浮系的方法構(gòu)建植物細(xì)胞表達(dá)載體通過Genbank注冊的所有植物p53基因的核苷酸序列，選定其兩個保守區(qū)各50個堿基對的核苷酸序列分別為正向片段I和II，并以其為依據(jù)分別設(shè)置其對應(yīng)的反向序列(I’和II’ );根據(jù)兩對正、反序列設(shè)計(jì)出合適的引物，在PCR擴(kuò)增過程中，使正反片段分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(EcoR I和Hind III)和相應(yīng)的⑶-AG類內(nèi)含子端部核苷酸序列。結(jié)果見表I。經(jīng)過酶切、再連接、轉(zhuǎn)化、克隆和鑒定后，得到了四片段的I-AC-II’ -II-CT-I’序列產(chǎn)物；該產(chǎn)物插入到PCAMBIA2300植物表達(dá)載體，導(dǎo)入感受態(tài)農(nóng)桿菌EHA105，篩選出能轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的工程菌pCAM-RNAi-p53。表I p53基因保守區(qū)域DNA片段及其PCR引物的核苷酸序列
權(quán)利要求
1.一種縮短植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)周期的方法。其特征是 .1.構(gòu)建p53基因RNAi表達(dá)載體工程菌。通過比對Genbank注冊的植物p53基因的核苷酸序列，任選其兩個保守區(qū)核苷酸序列分別為正向片段I、II，并設(shè)置其對應(yīng)的反向序列I’和II’;結(jié)合引物設(shè)計(jì)引入⑶-AG類內(nèi)含子端部堿基，通過PCR構(gòu)建I-AC-II’ -II-CT-I’的RNAi片段；篩選出插在pCAMBIA2300表達(dá)載體并能轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的工程菌。.2.從外植體誘導(dǎo)早期愈傷組織；早期愈傷組織與根瘤農(nóng)桿菌工程菌共培養(yǎng)；隨后在含抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，篩選出抗性愈傷組織并進(jìn)行繼代培養(yǎng)；將松散的抗性愈傷組織在液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)物過篩后繼續(xù)進(jìn)行振蕩懸浮培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系。. 3.利用看護(hù)培養(yǎng)手段，從懸浮細(xì)胞中篩選出生長速度快、由單細(xì)胞系形成的愈傷組織；將該愈傷組織在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)物過篩后繼續(xù)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得由單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)組成的懸浮系；對該懸浮系的細(xì)胞形態(tài)大小、生長周期、主要代謝產(chǎn)物含量及其穩(wěn)定性等進(jìn)行鑒定，最后獲得的懸浮細(xì)胞作為種子進(jìn)入大規(guī)模培養(yǎng)。 .4.通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得植物細(xì)胞生長和產(chǎn)物積累的最適碳氮源、pH、溫度、溶氧量和最佳接種量等主要發(fā)酵工藝參數(shù)。
全文摘要
一種縮短植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)周期的方法，本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。首先，選定p53基因的兩個保守區(qū)分別為正向片段I、II以及對應(yīng)的反向序列I’和II’；構(gòu)建I-GU-II’-II-AG-I’的RNAi片段；篩選出其插在pCAMBIA2300植物表達(dá)載體的根瘤農(nóng)桿菌工程菌。然后，以甘草為例，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法依次獲得p53轉(zhuǎn)化的愈傷組織及其穩(wěn)定表達(dá)的懸浮細(xì)胞。再次，通過看護(hù)培養(yǎng)，利用懸浮細(xì)胞，篩選生長速度快、效果好的單細(xì)胞系愈傷組織以及由此形成的懸浮細(xì)胞系。最后，通過培養(yǎng)工藝優(yōu)化，獲得懸浮細(xì)胞生長和產(chǎn)物積累的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。利用本發(fā)明方法獲得的培養(yǎng)周期短、密度大、成本低、生產(chǎn)效率高的細(xì)胞系，為大規(guī)模開發(fā)和生產(chǎn)藥用植物有效成分提供優(yōu)質(zhì)種源。
文檔編號C12N5/02GK102839190SQ20121022972
公開日2012年12月26日 申請日期2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月5日
發(fā)明者李興林, 高潔, 曹愛佳, 韓楊, 肖天劍, 趙俊, 張黎明, 滿淑麗, 高文遠(yuǎn) 申請人:天津科技大學(xué)