專利名稱：Hla-a0201限制性抗mage抗原特異性ctl的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術開發(fā)與應用研究領域，涉及HLA-A0201限制性抗MAGE抗原特 異性CTL的制備方法。
背景技術：
一、腫瘤治療的困境與機會惡性腫瘤已成為人類第一號“殺手”，手術、放療與化療是治療腫瘤的三大常規(guī)方 法，能在短期內有效的減輕腫瘤負荷，但仍不能有效清除腫瘤細胞。微小殘留病灶、對放療、 化療的部分敏感和耐藥是腫瘤復發(fā)及轉移的根源，而復發(fā)與轉移正是腫瘤患者死亡的主要 原因。常規(guī)治療方法已力不從心，開發(fā)新型的腫瘤治療技術與產品迫在眉睫。二、細胞免疫治療技術的誕生與發(fā)展上世紀80年代起免疫學與腫瘤學的迅速發(fā)展，1982年美國NIH Rosenberg教授 為首的研究小組研制出淋巴因子活化的殺傷細胞(LAK)免疫療法，并在后續(xù)研究中對LAK 細胞的臨床應用進行了深入的探討。但是LAK細胞殺傷力不夠強，臨床應用需要大量輸 注(3X101(|-n)，另一方面擴增能力有限，需要在輸注細胞的同時大劑量應用白細胞介素-2 (IL-2) (10萬IU/kg,q8h),因而產生了相關的不良反應。而后Rosenberg又提出了腫瘤浸 潤淋巴細胞(TIL)，其殺瘤能力較LAK有了明顯提高，并且無需大劑量IL-2聯(lián)合應用，但細 胞需要從腫瘤組織中分離獲得，這極大限制其廣泛的臨床應用。在以上的工作基礎上，1991 年Stanford大學的Schmidt_Wolf等采用干擾素Y (IFN- y )、IL-2和鼠抗人CD3單克隆 抗體(Mouse anti-Human CD3mAb)共同誘導出了具有強大抗腫瘤活性的細胞群，命名為細 胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)。樹突狀細胞(DCs)是迄今為止已知的體內功能最為強大的專職抗原遞呈細胞 (APC)，其表面存在豐富的抗原捕獲分子，抗原遞呈分子(MHC I類和MHC II類分子)，免疫共 刺激分子(⑶80、⑶83、⑶86、⑶40等)。經抗原刺激后的DC細胞向淋巴結遷移，將其攜帶的 抗原信息傳遞給相應的T淋巴細胞，啟動、激發(fā)CD4+/CD8+T細胞免疫應答，特異性地殺滅腫 瘤細胞。同時經抗原刺激后的DCs可分泌白細胞介素-8 (IL-8)、干擾素a (IFN-a)、白 細胞介素-12 (IL-12)、腫瘤壞死因子a (TNF-a )等，增強機體非特異性免疫應答(天然免 疫)，故DC有“天然免疫佐劑”的美稱，其發(fā)現(xiàn)者Ralph Steinman教授獲得2011年諾貝爾 醫(yī)學獎。鑒于DC在機體免疫防御系統(tǒng)中所處的中心地位，基于DC開發(fā)的抗腫瘤疫苗已使 之成為最先進、最有希望的腫瘤免疫治療技術之一，近年來國內外學者對其進行了廣泛的 探索。1992年Stanford醫(yī)學院的2位教授成立了世界上第一家以DC為基礎的腫瘤疫苗公 司(Dendreon, CA),該公司的產品Provenge已于2010年4月29日獲得FDA批準上市。但 是DC在體內的功能受到患者本身免疫狀態(tài)，腫瘤微環(huán)境的影響，而腫瘤患者體內存在大量 抑制因子，因此DC的體內效果并不如體外效果理想。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)構建是近期興起的免疫治療技術，因其具有特異、直接 殺傷腫瘤靶細胞的能力，因此成為研究的熱點。
三、MAGE基因在腫瘤免疫治療中的作用黑色素瘤相關抗原基因(Melanomaantigen-encoding Genes, MAGEs)包括 MAGE-A,-B和-C家族，它們表達于各種類型的腫瘤組織中，包括黑色素瘤、食管癌、肝癌、多 發(fā)性骨髓瘤、子宮癌、口腔鱗癌等等，而不表達于正常組織，除了睪丸生殖細胞，編碼一系列 能夠被CTLs識別的抗原。目前人類已發(fā)現(xiàn)有MAGE基因編碼的、能夠被CTL特異性識別的 抗原肽包括有MAGE-A1編碼，HLA-A1遞呈的9肽EADPTGHSY，MAGE-A2編碼，HLA-A0201遞 呈的 9 肽 KMVELVHFL，MAGE-A3 編碼，HLA-A24 遞呈的 9 肽 MPKAGLLI，MAGE_A4 編碼，HLA-A2 遞呈的10肽GVYDGREHTV等等。由于MAGE基因在腫瘤中的特異性表達以及它們能夠引起 特異性的CTL的腫瘤殺傷作用，使得MAGE基因編碼的抗原成為腫瘤治療的靶抗原。研究人 員通過先前的臨床試驗已經證實MAGE-A3多肽能夠誘導免疫應答，在28-55%的患有轉移性 黑色素瘤的患者中引起了腫瘤的消退。Bricard等發(fā)現(xiàn)MAGE-A10特異性的CTL在腫瘤損害 部位密集，而在正常肝組織中不存在，同時，CTL在體外具有強大的殺傷腫瘤細胞的能力，因 此對肝癌具有抗腫瘤作用，從而使通過應用MAGE-A10對肝癌進行免疫治療成為可能。四、CTL作用機理1、機體T細胞免疫反應過程機體存在龐大的T細胞庫，通過其表面表達不同的T細胞受體(TCR)特異識別不 同的外部抗原分子(細菌、病毒和腫瘤抗原多肽)，被活化為具有殺滅靶細胞的CTL，清除細 菌、病毒的感染和腫瘤細胞，且能產生免疫記憶性CTL，防止細菌、病毒的再次入侵和腫瘤的 復發(fā)。CTL免疫應答大致分四個階段(1)抗原識別APC通過表面受體識別并捕獲抗原(細菌、病毒、腫瘤細胞)；(2)抗原加工與遞呈抗原經APC消化、裂解成多肽分子，后者與APC胞內豐富的 MHC- I類或II類分子結合分別形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽復合物，并被轉運至APC表 面；(3) T細胞激活(雙信號學說)APC與T細胞相遇，T細胞通過自身TCR識別APC 遞呈的MHC-I/II-多肽復合物，其中⑶8+T細胞識別MHC-I-多肽復合物，⑶4+T細胞識別 MHC-II-多肽復合物，T細胞接受了抗原的刺激信號(第一信號)加上免疫共刺激信號(第二 信號)開始活化，具有細胞毒性作用即CTL ；(4)靶細胞殺滅活化CTL循環(huán)至抗原所在部位，通過CTL表面的TCR特異識別抗 原表達細胞后進行殺傷和清除。但，已發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內存在大量免疫抑制因子，影響CTL的有效活化和增殖，數(shù) 量甚少，不足以與迅速增殖的腫瘤抗衡。若能在體外制備大量抗原特異性CTL并回輸給患 者，可直接、快速殺傷腫瘤細胞起到治療作用，對常規(guī)治療無法清除的殘留腫瘤細胞進行殺 滅，將可以防止腫瘤的復發(fā)和轉移。2、CTL表型與功能差異根據(jù)CTL表面分子的表達種類可分為兩型中央記憶型CTL (CTL_cm)和效應記憶 型 CTL (CTL_em)。Klebanoff等研究發(fā)現(xiàn)表型分析為CD3+CD45R0+CD62L+CCR7+的CTL^具有更強 的抗腫瘤能力Johnson等比較了 MART-1 TCR基因修飾的CTL_cm和CTL_EM，結果發(fā)現(xiàn)前者消退惡性黑色素瘤細胞的能力是后者的10倍。Berger等研究結果還顯示CTL.輸注后較表 型為CD3+CD45R0+CD62L-CCR7-的CTL_EM在體內能存活更長的時間。3、CTL技術開發(fā)現(xiàn)狀綜合國內、國外CTL體外制備技術可歸類為三種方法與來源(1)腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)體外擴增法從腫瘤患者腫瘤組織中分離TIL，加入白細胞介素-2(IL_2)培養(yǎng)，克隆稀釋法篩 選腫瘤抗原陽性的T細胞克隆，再加入鼠抗人CD3單克隆抗體和IL-2進行擴增培養(yǎng)獲得。Li等選擇HLA-A201陽性的IV期惡性黑色素瘤患者，將其腫瘤組織制備成單細胞 懸液后，加入IL-2培養(yǎng)，5周后篩選擴增細胞中⑶8+T+MART-1+的陽性T細胞克隆，再加入 鼠抗人CD3單克隆抗體和輻照后的PBMC飼養(yǎng)細胞擴增培養(yǎng)，次日加入IL-2，再培養(yǎng)12天可 獲得CTLs，能對負載MART-1多肽的T2細胞株特異性識別和殺傷。(2)TCR基因修飾法TCR是T細胞識別抗原、介導免疫應答的關鍵分子，包括a、0YS四條鏈，由二 硫鍵連接成a/0和Y/S兩種異二聚體，其中a/0+T細胞占外周血T細胞的90-95%， 是主要的免疫效應細胞。TCR基因修飾即通過外源質粒轉染自體T淋巴細胞，導入能識別特 異性抗原多肽的TCR基因，挑選陽性克隆，在體外擴增培養(yǎng)獲得CTL。較為常用的質粒有逆 轉錄病毒質粒或慢病毒質粒。Morgan等采用抗⑶3+⑶28+磁珠激活⑶8+T細胞，應用慢病毒質粒轉染修飾 MART-1或gplOO特異性的TCR基因，采用鼠抗人⑶3單克隆抗體和IL-2培養(yǎng)體系制備 CTLs，在12天能擴增培養(yǎng)至109個細胞，用于15例HLA-A2+的黑色素瘤患者的治療，結果 顯示有2例患者出現(xiàn)了明顯的臨床療效，1例52歲男性患者的腋窩轉移病灶消失，肝轉移病 灶縮小了 89%，無病生存期為21個月；1例30歲男性患者，肺部轉移病灶消失，無病生存期 為20個月。Perro等采用白細胞介素-15 (IL-15)和白細胞介素_21 (IL-21)細胞因子組合 促進TCR基因轉染非增殖的T細胞，可以維持T細胞高表達⑶62L和⑶28。 (3)體外抗原致敏法用人工APC (Artificial APC)，或抗原(蛋白質，多肽，或全細胞)體外反復刺激T 細胞，獲得抗原特異性CTL。浙江大學的發(fā)明專利(專利號CN102168066A)體外誘導乙型肝炎病毒特異性細胞 毒性T淋巴細胞的方法即采用該方法。將MHC- I -lg和抗⑶28mAb包被磁珠構建人工APC， 抗原表位肽負載APC后，體外致敏3-4周，再以磁珠吸附分離抗原特異性CTL，Tetramer染 色鑒定。上述三種方法的缺陷(1) TIL體外擴增法①需要獲得患者的新鮮腫瘤組織作為CTL來源，僅限于可手術的患者，且腫瘤組 織來源有限；②TIL分離，CTL克隆的獲取與鑒定方法復雜，腫瘤組織中各種細胞成分較多，較 復雜，分離細胞的時間長，一般都需要1個月以上；③TIL中混有⑶4+⑶25+Treg亞群，其會抑制CTL擴增效率；
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所述的制備方法，步驟b中負載目標抗原的自體成熟DC是通過下列方法制備得到 的PBMC貼壁后加入rhGM-CSF、rhIFN a、滅活的混合正常人AB血清和RPMI1640培養(yǎng)基培 養(yǎng)三天，收獲的DC再加入目標抗原孵育即得。所述的制備方法，步驟c中用于目標CTL擴增的、射線輻照的自體PBMC是通過下 列方法制備得到的留取部分單采獲得的PBMC，經30-50GY的、射線輻照后保存；保存液 含20% (V/V)DMS0和20% (V/V)正常人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)液，保存溫度_80°C超 低溫保存。所述的制備方法，步驟d中用于目標CTL擴增的anti-human-⑶3mAb是如下操作 的將anti-human-Q)3mAb固相包被于用于擴增細胞的容器表面,anti-human-Q)3mAb可與 多個CTL表面的CD3分子結合，促進CTL細胞克隆的形成，促進細胞接觸，快速進入增殖周期。所述的制備方法，各步驟中刺激分子或細胞的用量分別為a.目標CTL第一輪擴增每次加入量rhIL_2終濃度為500_750IU/ml，rhIL-7終 濃度為50-75ng/ml，DC與起始T細胞數(shù)量比為1:5;b.目標CTL第二輪擴增rhIL-2終濃度為200_500IU/ml，rhIL-15終濃度為 100-250ng/ml，CD3單克隆抗體包被濃度為1. 0-2. 5 u g/ml, y射線輻照的PBMC與起始CTL 數(shù)量比為2 1。所述的制備方法，各步驟操作后細胞數(shù)量與表型特征見表1。表權利要求
1.HLA-A0201限制性抗MAGE抗原特異性CTL的制備方法，其特征在于該方法包括下列 步驟a.CTL前體細胞來源細胞的富集與純化單采收集外周單個核細胞作為CTL前體細胞來源；采用臨床級陰性磁珠分離法，從收 集外周單個核細胞中富集、純化CTL前體細胞即CD8+T淋巴細胞；b.目標CTL誘導與第一輪擴增用負載HLA-A0201限制性MAGE抗原多肽的成熟樹突狀細胞刺激CD8+T淋巴細胞，同時 加入rhIL-2和rhIL-7兩種細胞因子聯(lián)合促進T細胞生長；第二周再重復刺激一次，完成第 一輪擴增；c.目標CTL純化方法采用Tetramer標記方法和流式細胞分選術純化目標CTL,即選擇Tetramer+Q)8+T淋巴 細胞；d.目標CTL第二輪擴增采用固相包被的anti-human-⑶3mAb和IL-2刺激目標CTL的生長；加入經、射線福 照后的自體外周單個核細胞增強對目標CTL的活化；加入rhIL-15繼續(xù)培育，完成第二輪擴 增，收集鑒定。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟b中HLA-A0201限制性MAGE抗原 多肽長度為9-15個氨基酸。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的HLA-A0201限制性MAGE抗原多 肽，位點為271-279，序列如SEQ ID NO. 1所示。
4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟b中負載目標抗原的自體成熟DC 是通過下列方法制備得到的將外周單個核細胞貼壁后加入含rhGM-CSF、rhIFNa、滅活的 混合正常人AB血清和RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)三天，收獲DC再加入目標抗原孵育即得。
5.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟c中用于目標CTL擴增的、射線 輻照的自體外周單個核細胞是通過下列方法制備得到的留取部分權利1中單采獲得外周 單個核細胞，經30-50GY的、射線輻照后保存；保存液含20% (V/V)DMS0和20% (V/V) 正常人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)液，保存溫度-80°C超低溫保存。
6.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟d中用于目標CTL擴增的 anti-human-Q)3mAb是如下操作的將anti-human-Q)3mAb固相包被于用于擴增細胞的容 器表面，anti-human-⑶3mAb可與多個CTL表面的⑶3分子結合，促進CTL細胞克隆的形成， 促進細胞接觸，快速進入增殖周期。
7.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于目標CTL是指表達識別載HLA-A0201 限制性MAGE抗原多肽TCR的CD8+T，即Tetramer+CD8+T淋巴細胞。
8.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于各步驟中刺激分子或細胞的用量分別為a.目標CTL第一輪擴增每次加入量rhIL-2終濃度為500_750IU/ml，rhIL-7終濃度 為50-75ng/ml，DC與起始CD8+T細胞數(shù)量比為1:5;b.目標CTL第二輪擴增rhIL-2終濃度為200_500IU/ml，rhIL-15終濃度為 100-250ng/ml，CD3單克隆抗體包被濃度為1. 0-2. 5u g/ml, y射線輻照的外周單個核細胞與起始CTL數(shù)量比為2 I。
9.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于各步驟操作后細胞數(shù)量與表型特征分 別為
全文摘要
本發(fā)明公開了HLA-A0201限制性抗MAGE抗原特異性CTL的制備方法。該方法通過單采收集外周單個核細胞，富集、純化CD8+T淋巴細胞；用負載HLA-A0201限制性MAGE抗原多肽的成熟樹突狀細胞刺激CD8+T淋巴細胞，并用rhIL-2和rhIL-7聯(lián)合促進T細胞生長；采用Tetramer標記方法和流式細胞分選術純化目標CTL；采用固相包被的抗人CD3單抗和IL-2刺激目標CTL的生長；加入γ射線輻照后的自體PBMC增強目標CTL的活化；加入rhIL-15培育擴增，收集鑒定。本方法制備的目標CTL具備高純度，高增殖能力，高殺傷活性，高比例CTL-CM，可用于腫瘤等免疫治療。
文檔編號C12N5/0783GK102719401SQ201210231840
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月5日 優(yōu)先權日2012年7月5日
發(fā)明者時宏珍 申請人:時宏珍