一種胃黏膜上皮細胞atp4b啟動子驅動的sv40t-gfp真核表達載體的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，是包含ATP4B啟動子序列、SV40T基因序列、以及攜帶綠色熒光蛋白GFP基因序列的載體質粒DNA序列的基因融合重組質粒；該真核表達載體通過以下步驟構建：步驟1，克隆ATP4B啟動子序列；步驟2，將步驟1所得的ATP4B啟動子序列插入攜帶GFP基因序列的載體質粒中，并進行驗證；步驟3，將SV40T基因序列插入步驟2所得的攜帶ATP4B啟動子序列和GFP基因序列的載體質粒，并進行酶切鑒定和測序。本發明提供的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，對細胞無損傷，且具有經濟簡便的優點，并可以為進一步研究胃癌發生機制及開展胃癌的診斷與基因治療奠定提供研究對象，奠定實驗基礎。
【專利說明】—種胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種真核表達載體，具體地，涉及一種胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP融合基因的真核表達載體。
【背景技術】
[0002]胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，據世界衛生組織(WH0)2006年度報道，2005年全球65億人口中因癌癥死亡的有760萬人，約占當年5800萬死亡總人數的13%，其中胃癌居腫瘤死亡率的第二位，每年約有100多萬病人死于胃癌，資料還表明世界近三分之二的胃癌病例在發展中國家。在我國，胃癌死亡率一直居惡性腫瘤死亡的第一位，上海市也是全國胃癌相對聞發區之一，胃癌死亡率為35.32/10萬。胃癌是個多因素的疾病，隨著對癌基因研究的不斷深入，發現與140多種基因及其蛋白產物密切相關。近年來，隨著人們對腫瘤免疫、腫瘤病因及分子機制等研究的不斷深入，惡性腫瘤的基因治療已成為當前臨床腫瘤研究的新熱點。腫瘤基因治療已成為目前攻克和治愈腫瘤最具希望的，也是最活躍的領域。
[0003]SV40 (simian virus 40)是20世紀60年代初發現并分離出的猿猴腎細胞病毒，具有轉化動物細胞和誘發腫瘤的特性。SV40Tag (SV40T，猿猴病毒抗原蛋白)被廣泛用于腫瘤發病機制的研究與轉基因動物模型的建立，如利用SV40T基因已建立了小鼠腦脈絡叢乳頭狀瘤、胰腺癌、肝癌等轉基因動物模型。
[0004]H+/ K+ ATP酶(H+/ K+ ATPase)基因在胃黏膜上皮細胞中特異性表達，和胃酸的合成與分泌有著直接的關系。
[0005]綠色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)基因是1992年被克隆鑒定的新的報告基因。研究表明，GFP所產生的熒光無種屬特異性，不干擾細胞的生長與功能，可耐受光漂白，表達檢測時不需要任何協同因子，也不需要底物。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種胃黏膜上皮細胞H+/ K+ ATPaseP亞基(ATP4B)啟動子驅動下的SV40Tag-GFP融合基因的真核表達載體，為進一步研究胃癌發生機制及開展胃癌的診斷與基因治療奠定提供研究對象，奠定實驗基礎。
[0007]為了達到上述目的，本發明提供了一種胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，該真核表達載體是包含ATP4B啟動子序列、SV40T基因序列、以及攜帶綠色突光蛋白GFP基因序列的載體質粒DNA序列的基因融合重組質粒；所述的ATP4B啟動子序列是在胃黏膜上皮細胞中特異性表達的H+/ K+ ATP酶的β亞基啟動子序列，和胃酸的合成與分泌有關；所述的SV40T序列是猿猴病毒抗原蛋白基因序列，該蛋白具有轉化動物細胞和誘發腫瘤的特性，SV40T被廣泛用于腫瘤發病機制的研究與轉基因動物模型的建立；所述的綠色熒光蛋白GFP基因是報告基因，所述的報告基因(importer gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，即是一種其表達產物非常容易被鑒定的基因，把它的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控，篩選得到轉化體；所述的載體質粒是可以在宿主中復制和生存的真核表達質粒。
[0008]上述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其中，所述的真核表達載體通過以下方法構建:步驟1，克隆ATP4B啟動子序列；步驟2，將步驟I所得的ATP4B啟動子序列插入攜帶GFP基因序列的載體質粒中，并進行驗證；步驟3，將SV40T基因序列插入步驟2所得的攜帶ATP4B啟動子序列和GFP基因序列的載體質粒，并進行酶切鑒定和測序。
[0009]上述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其中，所述的步驟I的克隆ATP4B啟動子序列，是以小鼠DNA為模板，經PCR擴增后獲得ATP4B啟動子序列，其大小為1022bp。
[0010]上述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T~GFP真核表達載體，其中，所述的PCR擴增，上游引物為 5’ ~GCTCTTTCCTCTGGGTCTGT-3’，下游引物為 5’ ~GMGCGTCCTCTAGGGCTTA-3’，退火溫度為57°C。
[0011]上述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其中，所述的步驟2將ATP4B啟動子序列插入攜帶GFP基因序列的載體質粒，是將攜帶GFP基因序列的載體經限制性內切酶酶切后，去除其包含的啟動子，經瓊脂糖電泳純化后，再插入構建好的包含限制性內切酶位點的ATP4B啟動子序列。所述的限制性內切酶是能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶，是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息，由于這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性內切酶。
[0012]上述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其中，所述的步驟2將ATP4B啟動子序列插入攜帶GFP基因序列的載體質粒，是以所述的步驟I構建的ATP4B克隆為模板，利用包含Asel和Xholl兩個內切酶位點的引物將其插入攜帶GFP基因序列的載體質粒。
[0013]上述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其中，所述的包含Asel和Xholl兩個內切酶位點的引物為:
上游引物 5’ -GCATTAATTTCCTCTGGGTCTGTTTGGT-3’ ASEl，
下游引物 5’ -TTCTCGAGGCCCAGGAAGCGTCCTCTAGGGCTTA3’ XHOl0
[0014]上述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其中，所述的步驟2的驗證,是采用限制性內切酶Nhel/Sacl和Asel/Xhol進行酶切驗證,所得結果分別為718bp和1022bp。
[0015]上述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其中，所述的步驟3的酶切鑒定，是采用Pstl和Asel進行酶切驗證，所得結果分別為2000bp和849bp、2049bp。
[0016]本發明提供的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅`動的SV40T-GFP真核表達載體具有以下優點。
[0017]本發明采用GFP做陽性選擇報告基因，既對細胞無損傷，又經濟簡捷，是提高基因轉移與篩選效率的理想途徑。
[0018]可將所得的真核表達載體導入小鼠受精卵的雄原核中，建立轉基因綠色熒光小鼠動物模型，具有可比性、可重復性、可靠性、適用性和可控性、易行性和經濟性等特點，可以為胃癌發生機制的研究、胃癌的診斷與基因治療提供具有實用價值的實驗動物模型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為PCR擴增的ATP4B啟動子序列的電泳結果。
[0020]圖2為插入ATP4B啟動子序列的攜帶GFP基因序列的載體(ATP-1RES -GFP質粒)進行Nhel/Sacl和Asel/Xhol酶切驗證的電泳結果。
[0021]圖3為將ATP4B-1RES-GFP載體連接到pMD18_T載體上后再進行Nhel /Xball酶切驗證的電泳結果。
[0022]圖4為插入 SV40T基因序列的攜帶ATP4B啟動子序列和GFP基因序列的載體(ATP4B-SV40T-1RES-GFP)進行Pstl和Asel酶切驗證的電泳結果。
【具體實施方式】
[0023]以下結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步地說明。
[0024]1.ATP4B啟動子的克隆。
[0025]設計引物序列如下:
上游引物:5’-GCTCTTTCCTCTGGGTCTGT-3’
下游引物:5’-GAAGCGTCCTCTAGGGCTTA-3’
以小鼠DNA為模板，經PCR擴增后獲得ATP4B啟動子序列，退火溫度為57 °C，大小1022bp,電泳結果如圖1所示。
[0026]2.構建 ATP4B-1RES-GFP 質粒。
[0027](I)設計ATP4B引物，應包括Asel和Xholl兩個內切酶位點，故設計引物如下: 上游引物:5’-GCATTAATTTCCTCTGGGTCTGTTTGGT-3’ (ASEl)
下游引物:5’-TTCTCGAGGCCCAGGAAGCGTCCTCTAGGGCTTA3’ (XH01)。
[0028](2)取pIRES-GFP載體經限制性內切酶酶切后，去除CMV啟動子，經瓊脂糖電泳純。
[0029](3)插入構建好的包含限制性內切酶位點的ATP4B啟動子序列，獲得ATP4B-1RES-GFP質粒，并用限制性內切酶Nhel/Sacl和Asel/Xhol酶切驗證，所得結果如圖2所示:Nhel/Sacl酶切得到718bp的條帶為正確克隆，Asel/Xhol酶切得到1022bp的條帶為正確克隆，即1-4號均為正確條帶。
[0030](4)再將ATP4B-1RES-GFP載體連接到pMD18_T載體上，分別用Nhel/Xball內切酶進行驗證。結果如圖3所示，反向連接得到718bp的條帶(TM=55°C，即解鏈溫度為55°C)，正向連接得到318bp的條帶(TM=55°C)，均為正確克隆，即使用限制性內切酶Asel/Xholl切下片段后純化，2、3號均為正確條帶。
[0031]3.構建 ATP4B-SV40T-1RES-GFP 質粒。
[0032]取pCDNA3.1- SV40T質粒經BmaHI酶切，獲得2700bp的SV40T基因片段，將其插入ATP-1RES-GFP載體，并進行酶切鑒定(采用Pstl和Asel )，以及測序。
[0033]酶切鑒定結果如圖4所示，Pstl酶切2000bp條帶為正確克隆，Asel酶切849bp和2049bp條帶均為正確克隆，即1-4號均為正確條帶。
[0034]測序結果如下所示。
[0035]ATP4B-SV40T-1RES-GFP 序列:
【權利要求】
1.一種胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，該真核表達載體是包含ATP4B啟動子序列、SV40T基因序列、以及攜帶綠色熒光蛋白GFP基因序列的載體質粒DNA序列的基因融合重組質粒； 所述的ATP4B啟動子序列是在胃黏膜上皮細胞中特異性表達的H+/ K+ ATP酶的β亞基啟動子序列； 所述的SV40T序列是猿猴病毒抗原蛋白基因序列； 所述的綠色熒光蛋白GFP基因是報告基因； 所述的載體質粒是可以在宿主中復制和生存的真核表達質粒。
2.如權利要求1所述的胃黏膜上皮細胞ΑΤΡ4Β啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的真核表達載體通過以下方法構建: 步驟1，克隆ΑΤΡ4Β啟動子序列； 步驟2，將步驟I所得的ΑΤΡ4Β啟動子序列插入攜帶GFP基因序列的載體質粒中，并進行驗證； 步驟3，將SV40T基因序列插入步驟2所得的攜帶ΑΤΡ4Β啟動子序列和GFP基因序列的載體質粒，并進行酶切鑒定和測序。
3.如權利要求2所述的胃黏膜上皮細胞ΑΤΡ4Β啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的步驟I的克隆ΑΤΡ4Β啟動子序列，是以小鼠DNA為模板，經PCR擴增后獲得ΑΤΡ4Β啟動子序列，其大小為1022bp。
4.如權利要求3所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的PCR擴增， 上游引物為 5’ -GCTCTTTCCTCTGGGTCTGT-3’， 下游引物為 5’ -GAAGCGTCCTCTAGGGCTTA-3’， 退火溫度為57°C。
5.如權利要求2所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的步驟2將ATP4B啟動子序列插入攜帶GFP基因序列的載體質粒，是指將攜帶GFP基因序列的載體經限制性內切酶酶切后，去除其包含的啟動子，經瓊脂糖電泳純化后,再插入構建好的包含限制性內切酶位點的ATP4B啟動子序列。
6.如權利要求5所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的步驟2將ATP4B啟動子序列插入攜帶GFP基因序列的載體質粒，是以所述的步驟I構建的ATP4B克隆為模板，用包含Asel和Xholl兩個內切酶位點的引物將其插入攜帶GFP基因序列的載體質粒。
7.如權利要求6所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的包含Asel和Xholl兩個內切酶位點的引物為: 上游引物 5’ -GCATTAATTTCCTCTGGGTCTGTTTGGT-3’ ASEl， 下游引物 5’ -TTCTCGAGGCCCAGGAAGCGTCCTCTAGGGCTTA3’ XHOl0
8.如權利要求2所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的步驟2的驗證,是指采用限制性內切酶Nhel/Sacl和Asel/Xhol進行酶切驗證。
9.如權利要求2所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的步驟3的酶切鑒定，是指采用Pstl和Asel進行酶切驗證。
【文檔編號】C12N15/66GK103627720SQ201210232385
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年7月6日 優先權日:2012年3月5日
【發明者】范忠澤, 王金玉, 孫玨, 李琦, 趙成根, 張隆, 殷佩浩, 李大力, 葉乃菁 申請人:上海中醫藥大學附屬普陀醫院