專利名稱：S-苯基-l-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及S-苯基-L-半胱氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法。背景技術(shù)：
S-苯基-L-半胱氨酸是一種非蛋白質(zhì)組成的氨基酸，其所帶的巰基具有重要的生理功能，S-苯基-L-半胱氨酸是治療艾滋病藥物萘非那韋(抗HIV蛋白酶抑制劑Nelfinavir)的合成原料(US5484926 ;EP0889036)。S-苯基-L-半胱氨酸可用于化妝品添加劑、醫(yī)藥領(lǐng)域、食品領(lǐng)域和飼料添加劑領(lǐng)域等，具有非常廣泛的應(yīng)用。根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)S-苯基-L-半胱氨酸的制備方法主要有化學(xué)合成法和酶轉(zhuǎn)化 法。I、化學(xué)合成法
S-苯基-L-半胱氨酸的化學(xué)合成法主要利用銅催化L-半胱氨酸和苯胺重氮鹽的反應(yīng)，最后得到S-苯基-L-半胱氨酸，S-苯基-L-半胱氨酸化學(xué)合成的反應(yīng)步驟多，操作難度大，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。王建武等(中國藥物化學(xué)雜志，2000，(10)4 =283-284)采用銅催化L-半胱氨酸和苯胺重氮鹽反應(yīng)合成S-苯基-L-半胱氨酸，苯胺溶于濃鹽酸中，滴加亞硝酸鈉得到重氮鹽，加入半胱氨酸鹽酸鹽和氯化亞銅，反應(yīng)后在通風(fēng)櫥中加入硫化鈉抽濾，用氨水調(diào)pH6，白色晶體析出，過濾，烘干，產(chǎn)率為60%，純度為95%。高玉冠等(CN 200410089193. 9，2005)用亞硝酸鈉與苯胺反應(yīng)成苯胺重氮鹽，苯胺重氮鹽再與L-半胱氨酸溶液進(jìn)行反應(yīng)，加入氯化亞銅，然后用硫化鈉進(jìn)行脫銅反應(yīng)，抽濾，調(diào)PH6，過濾烘干得到粗品S-苯基-L-半胱氨酸，產(chǎn)率50%。張關(guān)永等(CN 03128884. 7，2003)將L-半胱氨酸鹽酸鹽與可溶性一價(jià)銅鹽反應(yīng)生成銅的絡(luò)合物，然后與苯胺重氮鹽反應(yīng)生成S-苯基-L-半胱氨酸，加入可溶性硫化物溶液進(jìn)行脫銅反應(yīng)，冷卻，過濾，濾液中加入氨水進(jìn)行中和，采用乙醇和水混合液對粗品S-苯基-L-半胱氨酸重結(jié)晶。2、酶轉(zhuǎn)化法
酶法轉(zhuǎn)化因具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而日益受到重視，酶促轉(zhuǎn)化法具有終產(chǎn)物積累量高、反應(yīng)周期短、分離提純?nèi)菀椎葍?yōu)點(diǎn)，它是廉價(jià)生產(chǎn)S-苯基-L-半胱氨酸有效的方法，國內(nèi)外研究者利用色氨酸合成酶酶法制備S-苯基-L-半胱氨酸，酶法生產(chǎn)S-苯基-L-半胱氨酸已成為近年來人們關(guān)注和研究的方向。Thomas HP Maier (Nature Biotechnology, 21(4) :422-427,2003)以苯硫酌■和O-乙酰-L-絲氨酸為底物，pH調(diào)至6. 7，CysM酶酶法制備S-苯基-L-半胱氨酸，產(chǎn)率為72%。歐洲專利(EP1247869-A，2002)報(bào)道了采用含有O-乙酰-L-絲氨酸、苯硫酚和產(chǎn)CysM菌株DH5 a /pFL145細(xì)胞懸液制備S-苯基-L-半胱氨酸，pH調(diào)至6. 7，收率為65%。焦慶才等(BioresourceTechnology, 102 :3554-3557, 2011)以混合氛基酸含有的L-絲氨酸和吲哚為底物，以色氨酸合成酶酶法合成了 L-色氨酸。但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道色氨酸合成酶不僅能夠催化L-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸，還能催化純品L-絲氨酸和苯硫酚反應(yīng)生成S-苯基-L-半胱氨酸。日本專利(JP10001468A，1996 JP9313195-A，1997 JP9084592-A，1997)和美國專利(US5756319-A，1998)報(bào)道了以DL-絲氨酸或L-絲氨酸為底物，以苯硫酚為巰基供體，色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸，以上色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸的報(bào)道均以DL-絲氨酸純品或L-絲氨酸純品為底物。目前,我國S-苯基-L-半胱氨酸生產(chǎn)主要來源于化學(xué)合成法,該方法工藝成熟,但化學(xué)合成法反應(yīng)步驟多，操作難度大，生產(chǎn)成本高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。而另一方面我國在氨基酸工業(yè)生產(chǎn)中，會(huì)產(chǎn)生大量不能直接用于食品和醫(yī)藥方面的富含L-絲氨酸的混合氨基酸料液，該混合氨基酸料液直接分離制備L-絲氨酸成本高、效率低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是提供一種高效、低成本的制備S-苯基-L-半胱氨酸的方法。 本發(fā)明以氨基酸工業(yè)中富含L-絲氨酸的混合氨基酸料液為底物，色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸。本發(fā)明可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
S-苯基-L-半胱氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其步驟為
(I)具有色氨酸合成酶活性的大腸桿菌ATCC15489或銅綠假單胞菌CGMCC NO :1. 1129或施氏假單胞菌CGMCC NO: I. 202或枯草芽孢桿菌CGMCC NO: I. 1628，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生含色氨酸合成酶的濕菌體。(2)將含有色氨酸合成酶的濕菌體或粗酶液與含L-絲氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入磷酸吡哆醛和表面活性劑和苯硫酚或苯硫酚鈉，在25 55°C，pH 6 11條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)；反應(yīng)生成S-苯基-L-半胱氨酸。上述步驟(I)中的培養(yǎng)基碳源采用葡萄糖和麥芽糖和蔗糖和/或果糖，培養(yǎng)基中總碳源質(zhì)量濃度為5 50 g/L ;氮源采用牛肉膏和酵母膏和玉米漿和蛋白胨和/或豆餅水解液，培養(yǎng)基中總氮源質(zhì)量濃度為I 30 g/L。上述步驟(2)中含L-絲氨酸的混合氨基酸料液為角蛋白水解液或蠶絲水解液或酶法合成L-絲氨酸的反應(yīng)液，混合氨基酸料液中總氨基酸含量為1% 50%重量百分比，其中L-絲氨酸在總氨基酸中含量為5% 95%重量百分比。上述步驟(2)的轉(zhuǎn)化液中加入適量的表面活性劑吐溫-80或十六烷三甲基溴化銨(CTAB)或聚乙二醇辛基苯基醚(0P)，其濃度為O. 005 g/L 5. O g/L。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)
(O本發(fā)明采用含色氨酸合成酶的大腸桿菌ATCC15489或銅綠假單胞菌CGMCC NO
I.1129或施氏假單胞菌CGMCC NO: I. 202或枯草芽孢桿菌CGMCC NO: I. 1628，在優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以高效表達(dá)色氨酸合成酶，使酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸有較高的催化速率和轉(zhuǎn)化率，其中L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到84%以上。(2)本發(fā)明采用廉價(jià)的含L-絲氨酸的混合氨基酸料液為反應(yīng)原料，充分利用了工業(yè)副產(chǎn)物，解決了混合氨基酸料液中L-絲氨酸高效分離的難題，同時(shí)也為大規(guī)模低成本生產(chǎn)S-苯基-L-半胱氨酸提供了更為豐富的原料，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。(3)酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸具有反應(yīng)條件溫和，酶立體選擇性強(qiáng)，催化效率高，成本低，工藝流程簡單等優(yōu)點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。具體實(shí)施例方式 以下實(shí)施例僅用于對本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于以下實(shí)施例中。實(shí)施例一
I.將1000 mL大腸桿菌(ATCC15489)發(fā)酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含17. 5 g L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液(氨基酸總含量15%)、19 g苯硫酚、
0.2 g/L磷酸吡哆醛和O. 005 g/L OP, pH 8. 5，37°C酶促反應(yīng)15 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為29. 2 g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為89%。
pH O. 5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得27. 7 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得26. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實(shí)施例二
I.將1000 mL銅綠假單胞菌(CGMCC NO :1. 1129)發(fā)酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含36 g L-絲氨酸的蠶絲水解液(氨基酸總含量30%)、42 g苯硫酚、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐溫-80，pH 9. O，25 °C酶促反應(yīng)20 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為58. 2 g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為86 %。2.將轉(zhuǎn)化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細(xì)胞，上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH O. 5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得55. 3g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得51. 9 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實(shí)施例三
I.將1000 mL施氏假單胞菌(CGMCC NO: I. 202)發(fā)酵液離心得到濕菌體18 g，加入到500 mL轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)化液中含12 g L-絲氨酸的酶法制備L-絲氨酸料液、14 g苯硫酹、0.2g/L磷酸吡哆醛和O. 005 g/L吐溫-80，pH 6.0, 55°C酶促反應(yīng)15 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為19. 4 g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為86 %。2.將轉(zhuǎn)化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細(xì)胞，上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得17. 7 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得16. I g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l, I. 5 mol/L硫酸)。實(shí)施例四
I.將1000 mL枯草芽孢桿菌(CGMCC NO: I. 1628)發(fā)酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)化液中含48 g L-絲氨酸的酶法制備L-絲氨酸料液、56 g苯硫酹、
0.2 g/L磷酸吡哆醛和0.5 g/L吐溫-80，pH 9. 0，35°C酶促反應(yīng)20 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為79. 4 g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為88 %。2.將轉(zhuǎn)化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細(xì)胞，上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得75. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得71. 6 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實(shí)施例五
I.將1000 mL施氏假單胞菌(CGMCC NO: I. 202)發(fā)酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含60 g L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液(氨基酸總含量50%)、70 g苯硫酚、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L CTAB, pH 9，35°C酶促反應(yīng)20 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為94. 6 g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為84 %。2.將轉(zhuǎn)化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細(xì)胞，上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH O. 5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得89. 8 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得85. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。 實(shí)施例六
I.將1000 mL施氏假單胞菌(CGMCC NO: I. 202)發(fā)酵液離心得到18 g濕菌體，加入到500 mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含24 g L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液(氨基酸總含量20%)、28 g苯硫酚、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L OP, pH 11，35°C酶促反應(yīng)16 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為40. 2 g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為89 %。2.將轉(zhuǎn)化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細(xì)胞，上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得38. 2 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得36. 3 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實(shí)施例七
I.將1000 mL大腸桿菌(ATCC15489)發(fā)酵液離心得到18 g濕菌體，加入到500 mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含18 g L-絲氨酸的蠶絲水解液(氨基酸總含量15%)、21 g苯硫酚、0.2 g/L磷酸吡哆醛和0.5 g/L OP, pH 9. O，35°C酶促反應(yīng)15 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為29 g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為86 %。2.將轉(zhuǎn)化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細(xì)胞，上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得27. 5 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得26. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實(shí)施例八
I.將1000 mL銅綠假單胞菌(CGMCC NO :1. 1129)發(fā)酵液離心得到的18 g濕菌體，力口入到500 mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含12 g L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液(氨基酸總含量10%)、16. 8 g苯硫酚鈉、0. 2 g/L磷酸吡哆醛和0. 5 g/L CTAB, pH 9. O, 35°C酶促反應(yīng)15 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為19. 3 g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為86 %。2.將轉(zhuǎn)化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細(xì)胞，上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得17. 3 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得16. 5 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l, I. 5 mol/L硫酸)。實(shí)施例九
I.將1000 mL枯草芽孢桿菌(CGMCC NO: I. 1628)發(fā)酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含24 g L-絲氨酸的蠶絲水解液(氨基酸總含量20 %)、33. 6g苯硫酚鈉、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐溫-80，pH 9. 0，35°C酶促反應(yīng)18 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為38. 2 g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為85 %。2.將轉(zhuǎn)化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細(xì)胞，上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH O. 5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得36. 2 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得34. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實(shí)施例十
I.將1000 mL大腸桿菌(ATCC15489)發(fā)酵液離心得到18 g濕菌體，加入到500 mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含36 g L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液(氨基酸總含量30%)、50. 4 g苯硫酚鈉、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐溫-80，pH 9. O, 35°C酶促反應(yīng)20 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為57. I g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為85 %。 2.將轉(zhuǎn)化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細(xì)胞，上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH O. 5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得54. 2 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得51. 5 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實(shí)施例^^一
I.將100 mL枯草芽孢桿菌(CGMCC NO: I. 1628)發(fā)酵液離心得到2 g濕菌體，加入到50 mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含I. 2 g L-絲氨酸的蠶絲水解液(氨基酸總含量l%)、1.4g苯硫酚、0.2 g/L磷酸吡哆醛和0.005 g/L CTAB，pH 9. O，35°C酶促反應(yīng)5 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為I. 94 g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為86 %。2.將轉(zhuǎn)化液4000 r/min離心15 min,去除菌體細(xì)胞,上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得I. 82 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得I. 63 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。實(shí)施例十二
I.將1000 mL銅綠假單胞菌(CGMCC NO :1. 1129)發(fā)酵液離心得到20 g濕菌體，加入到500 mL轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)化液中含24 g L-絲氨酸的酶法制備L-絲氨酸料液、28 g苯硫酹、0.2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐溫-80，pH 9. 0，35°C酶促反應(yīng)18 h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中S-苯基-L-半胱氨酸為38. 7 g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為86 %。2.將轉(zhuǎn)化液4000 r/min離心15 min，去除菌體細(xì)胞，上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH 0.5，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液用5 mol/L NaOH調(diào)pH 3. 0，冷卻，析出沉淀，真空抽濾，純水洗滌，烘干得36. 7 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，經(jīng)酸溶脫色，中和結(jié)晶，真空抽濾，洗滌，烘干得34. 9 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)。
權(quán)利要求
1.一種S-苯基-L-半胱氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成 (1)具有色氨酸合成酶活性的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生含色氨酸合成酶的濕菌體； (2)將含有色氨酸合成酶的濕菌體或粗酶液與含L-絲氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入磷酸吡哆醛和表面活性劑和苯硫酚或苯硫酚鈉，在25 55°C，pH 6 11條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到S-苯基-L-半胱氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(I)所述的菌株是大腸桿菌ATCC15489或銅綠假單胞菌CGMCC NO :1. 1129或施氏假單胞菌 CGMCC NO: I. 202 或枯草芽孢桿菌 CGMCC NO: I. 1628。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(1)所述的培養(yǎng)基是葡萄糖和麥芽糖和蔗糖和/或果糖，培養(yǎng)基中總碳源質(zhì)量濃度為5 50g/L ;氮源采用牛肉膏和酵母膏和玉米漿和蛋白胨和/或豆餅水解液，培養(yǎng)基中總氮源質(zhì)量濃度為I 30 g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(2)所述的含L-絲氨酸的混合氨基酸料液來源于角蛋白水解液或蠶絲水解液或酶法合成L-絲氨酸的反應(yīng)液，混合氨基酸料液中總氨基酸含量為1% 50%重量百分比，其中L-絲氨酸在總氨基酸中含量為5% 95%重量百分比。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(2)所述的表面活性劑為吐溫-80或十六烷基三甲基溴化銨或聚乙二醇辛基苯基醚，其濃度為 0. 005 g/L 5. 0 g/L。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及S-苯基-L-半胱氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法。該制備方法采用含有L-絲氨酸的混合氨基酸料液為原料，將具有L-色氨酸合成酶活性的濕菌體或粗酶液與含有L-絲氨酸的混合氨基酸料液混合，添加適量苯硫酚或苯硫酚鈉，25～55℃，pH6～11條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物S-苯基-L-半胱氨酸。該方法解決了混合氨基酸料液中L-絲氨酸的分離及綜合利用難題，得到了附加值較高的S-苯基-L-半胱氨酸產(chǎn)品，具有原料來源廣、價(jià)格低廉，操作簡便，酶促轉(zhuǎn)化時(shí)間短、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12R1/385GK102808007SQ20121025162
公開日2012年12月5日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者焦慶才, 徐禮生, 劉均忠, 王治元, 張宏娟, 劉茜 申請人:南京大學(xué)