一株產漆酶具有電化學活性的耐高溫枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發明屬于應用生物學領域，特別涉及了一株經過誘導可以產生漆酶的并且具有電化學活性的枯草芽孢桿菌。誘導培養基成分為：蛋白胨10g/L,NaCl:10g/L,酵母提取物：5g/L，CuSO4.5H2O:1.6g/L,愈創木酚：1.6g/L。枯草芽孢桿菌經此培養基培養后可產生漆酶，取培養20天后菌液3000r/min，10min，去上清，用滅菌的去離子水清洗沉淀，至少3次，直至上清顏色為無色，用去離子水按照0.1g/ml將所得的菌體沉淀懸浮，采用循環伏安法檢測其電化學性能，該菌經60℃，80℃，100℃，120℃處理菌3h后仍然具有良好的電化學活性。該菌可以在室溫下降解纖維素為糖類，大大降低了纖維素降解的成本，可用于纖維素的降解。
【專利說明】一株產漆酶具有電化學活性的耐高溫枯草芽孢桿菌
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種可產漆酶的具有電化學活性的菌，具體涉及一株枯草芽孢桿菌，經誘導后可以產生漆酶且具有電化學活性。該菌在高溫處理后仍然具有良好的電化學活性，此外，本發明還涉及到該菌在室溫下即可以將纖維素降解為糖類，屬于應用生物學領域。。
【背景技術】
[0002]生物燃料電池是一種利用微生物產生電能的裝置，即通過微生物或生物大分子(如酶)的催化作用，將生物質中的化學能轉化為電能，在這個能量轉化的過程中，微生物或生物大分子是產電的關鍵的因素也是限制因素。現在的產電菌主要是屬于希瓦氏菌及鐵桿菌屬，產電菌的產電主要與蛋白或者酶或者其代謝中產生的具有電化學活性的物質有關系，因此利用現有的菌屬，誘導其產生具有電化學活性的酶是一條比較有效的途徑，此過程較從自然界中篩選菌可以大大縮短時間，且無需進行菌種鑒定等過程，可以大大減小成本。
[0003]漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，它可以利用活性中心的銅離子催化氧化多種結構的芳香族化合物，同時將分子氧還原成水，在此過程中伴隨著電子的傳遞。
[0004]在自然界中，漆酶廣泛存在于植物，動物，真菌和細菌中，目前主要是采用真菌來生產漆酶。但是由于細菌易培養，繁殖速度快且細菌漆酶較真菌漆酶有以下優點:耐酸堿，耐高溫且穩定性好，引起了人們越來越多的關注。細菌漆酶主要有三種形式:胞內，胞外及細胞組成型漆酶。其中穩定性最好的為細胞組成型漆酶，細胞組成型漆酶通常是指芽孢菌屬的漆酶，此類漆酶主要位于芽孢外膜上，由于芽孢對高溫，高壓及極端PH等逆性環境具有抗逆性，此類漆酶因此具有良好的溫度計PH穩定性。因此細菌漆酶在工業上具有更好的應用前景。枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，在其生長過程中可以產生種類繁多的維生素，有機酸，氨基酸及蛋白酶，糖化酶，脂肪酶，漆酶等，有著廣泛的用途。`
【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種株枯草芽孢桿菌經誘導后可以產生漆酶且具有電化學活性，該菌在高溫下依然具有電化學活性且該菌可以將纖維素降解為糖類。
[0006]本發明中誘導枯草芽孢桿菌產生漆酶的培養基為:蛋白胨10g/L，NaCl: 10g/L,酵母提取物:5g/L, CuS04.5H20: 1.6g/L,愈創木酚:1.6g/L。
[0007]本發明中電化學活性的測定是采用循環伏安法。具體操作步驟為:1:取用誘導培養基培養20天的菌,3000r/min, IOmin,去上清,用滅菌的去離子水清洗沉淀,至少3次,直至上清顏色為無色。用去離子水按照0.lg/ml將所得的菌體沉淀懸浮。
[0008]2:將I制備菌體懸浮液取5ul滴加到玻碳電極上，然后加IOul nafion溶液固定，置于65°C烘箱中30-60S使得菌體固定在玻碳電極上。
[0009]3:采用三電極體系進行電化學實驗，2制備好的電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，碳棒為對電極。[0010]4:采用0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液為反應體系，pH為4.68，掃描范圍為-0.3—
0.8V，掃描速率為30mV/s。
[0011]本發明所提供的經誘導后可產生漆酶且具有電化學活性的枯草芽孢桿菌，操作方法簡單，成本低。所制備的菌體懸浮液在高溫下仍保持很好的電化學活性且可以有效的降解纖維素成為糖類。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是枯草芽孢桿菌誘導前后的循環伏安圖。其中，a表示:誘導前的枯草芽孢桿菌，b表不:誘導后的枯草芽孢桿菌。
[0013]圖2是誘導后的枯草芽孢桿菌在添加丁香醛聯氮的緩沖液中的循環伏安圖。其中a是誘導后的枯草芽孢桿菌在緩沖液中的循環伏安圖，b是誘導后的枯草芽孢桿菌在添加有丁香醛聯氮的緩沖液中的循環伏安圖。
[0014]圖3是經不同溫度60°C，80°C，IOO0C，120°C處理3h后誘導的枯草芽孢桿菌的峰電
流曲線圖。其中，a表示:氧化電流，b表示:還原電流。
具體實施方案
[0015]實施例1:未經誘導的枯草芽孢桿菌無電化學活性，圖1枯草芽孢桿菌誘導前后的循環伏安圖:a:誘導前的枯草芽孢桿菌，b:誘導后的枯草芽孢桿菌，說明經誘導后枯草芽孢桿菌具有電化學活性。
[0016]實施例2:丁香醛聯氮可以作為電子中介體，以便實現漆酶和電極間的高效的電子傳遞。圖2:誘導后的枯草芽孢桿菌在添加丁香醛聯氮的緩沖液中的循環伏安圖，a:誘導后的枯草芽孢桿菌在緩沖液中的循環伏安圖，b:誘導后的枯草芽孢桿菌在添加有丁香醛聯氮的緩沖液中的循環伏安圖。從圖中可以看出當添加有丁香醛聯氮的時候，枯草芽孢桿菌的峰電流增加了 35 %。
[0017]實施例3:枯草芽孢桿菌可以耐高溫，分別用60°C，80°C，IOO0C，120°C處理菌3h后測其電化學性能，圖3經不同溫度60°C，80°C，100°C，120°C處理后3h后誘導的枯草芽孢桿菌的峰電流曲線，a:氧化電流，b:還原電流。在經過高溫處理后仍具有極好的電化學活性，經120°C處理后，其電化學性能仍有峰電流為室溫下的25 %，但在60°C，80°C，100°C時其電化學活性幾乎與室溫時相同，說明該菌具有極好的熱穩定性。
[0018]實施例4:纖維素是自然界中最豐富的可再生資源，但是由于纖維素特殊的晶體結構妨礙了纖維素的開發利用。將誘導后的枯草芽孢桿菌接種到含有以纖維素為唯一碳源的培養基中，培養10天后測培養基中還原糖的濃度可達到0.5g/L。
【權利要求】
1.這是一株經誘導后可產漆酶的具有電化學活性的枯草芽孢桿菌。
2.誘導培養基成分為:蛋白胨10g/L，NaCl:10g/L,酵母提取物:5g/L，CuSO4.5H20: 1.6g/L,愈創木酚:1.6g/L。
3.該菌經權利要求書2的培養基培養后，具有電化學活性。
4.該菌在高溫下仍存在電化學活性。
5.該菌可以降解纖維素 為糖類。
【文檔編號】C12N9/02GK103667092SQ201210344257
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月18日 優先權日:2012年9月18日
【發明者】陳立香, 吳冉冉, 趙峰 申請人:中國科學院城市環境研究所