專利名稱：細菌纖維素高產發酵培養基及細菌纖維素的發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌纖維素發酵培養基及細菌纖維素的發酵方法。
背景技術：
細菌纖維素(Bacterial Cellulose，BC)是一類由微生物產生的純纖維素，是葡萄糖單體分子以β_1，4-糖苷鍵聚合而成的高分子聚合物。與植物纖維相比，BC不含木質素和半纖維素，具有優良的生物親和性、生物相容性、生物適應性和良好的生物可降解性，被公認為世界上安全的性能優異的新型生物材料。在食品、造紙、聲學器材、石油開采和人造皮膚、醫用材料等領域有廣泛的應用前景。雖然BC因其優越性能，有廣泛應用前景，但產量低、附加值高是限制其進一步應用的“瓶頸”，這是菌株本身具有的代謝特性決定的。微生物發酵過程優化的目標在于提高 代謝產物的產量，但是在某種意義上來看結果具有不可預知性，這是由于菌株所具有的代謝特性所造成的。由于發酵過程的非線性、時變性和生物傳感器的缺乏以及各參數之間的嚴重關聯，給發酵過程建模帶來了很大的困難。發酵過程中因素復雜多變，并且各因素之間的交叉影響，試驗因素與其結果之間具有較強的離散性，因此使用常規方法建立的發酵模型相對而言比較粗放，誤差大。所以，無法通過常規方法確定細菌纖維素合理的培養基成分和發酵培養參數。

發明內容
本發明是為了解決目前細菌纖維素產量低的問題，而提供的一種細菌纖維素高產發酵培養基及細菌纖維素的發酵方法。本發明細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氫二鈉、O. 454% O. 458%的磷酸氫二鉀、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸懼水組成。利用上述細菌纖維素高產發酵培養基的細菌纖維素發酵方法按以下步驟實施一、將保存的細菌纖維素產生菌接種到固體培養基上進行菌種平板活化；二、種子培養用接種環挑取固體培養基上活化的細菌纖維素產生菌轉接到種子培養基，再放置于溫度為30°C、轉速為150r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24h,種子培養基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成；三、發酵培養按體積7%的接種量將種子培養基接入細菌纖維素高產發酵培養基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養箱中培養7天，即完成細菌纖維素的發酵；步驟三中細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氫二鈉、O. 454% O. 458%的磷酸氫二鉀、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始PH值為6. 5。本發明方法適用于多種細菌纖維素產生菌，如漢氏葡糖醋桿菌DHM1_3(保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址是武漢市，武漢大學，保藏日期為2010年12月5日，保藏號為 CCTCC NO :M2010332)、Gluconacetobacter europaeus 和醋化醋桿菌。米用本發明發酵方法發酵培養的漢氏葡糖醋桿菌、Gluconacetobacter europaeus和醋化醋桿菌的細菌纖維素產量大幅提升，增加量均超過80%。通過發酵培養基的改變，改變了細菌纖維素產生菌的代謝流量，其中更是涉及現代代謝工程理論及代謝通量、代謝物組學等方面的因素，因此，本發明不是簡單培養基成分的調整。漢氏葡糖醋桿菌DHM1-3(Gluconacetobacter hansenii DHM1-3)為漢氏葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter hansenii),屬于葡糖醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter);保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址是武漢市，武漢大學，保藏日期為2010年12月5日，保 藏號為 CCTCC NO M2010332o


圖I是優化前后細菌纖維素發酵代謝流分布。圖2是基本細菌纖維素發酵培養基發酵過程曲線圖，“ ”曲線為殘糖含量曲線，“〇”曲線為乙酸產量曲線，曲線為乙醇殘余量曲線，“■”曲線為菌體含量曲線，“▲”曲線為BC產量曲線。圖3是具體實施方式
五使用本發明細菌纖維素高產發酵培養基發酵細菌纖維素的過程曲線圖，“ ”曲線為殘糖含量曲線，“〇”曲線為乙酸產量曲線，曲線為乙醇殘余量曲線，“ ■”曲線為菌體含量曲線，“▲”曲線為BC產量曲線。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23 %的磷酸氫二鈉、O. 454 % O. 458 %的磷酸氫二鉀、2. 22 % 2. 23 %的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。本實施方式細菌纖維素高產發酵培養基降低了 HMP途徑流量，有利于細菌纖維素的合成；在Acetate節點，減少了進入TCA循環的無效碳循環造成的浪費，從而使更多的代謝流量進入了細菌纖維素合成途徑。本實施方式細菌纖維素高產發酵培養基中乙醇和乳酸的添加，能快速氧化進入TCA循環用于能量生成；另外由于乙醇的快速氧化產生高能荷的ATP，而高能荷的ATP是HMP途徑中關鍵酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制劑，從而在滿足菌體生長所需能量的條件下，使代謝流量更多的進入細菌纖維素合成方向。本實施方式細菌纖維素高產發酵培養基可控制發酵過程的pH值，確保更多代謝流量進入菌體生成及產物合成途徑,減少代謝副產物生成。
具體實施方式
二 本實施方式細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O. 19% O. 21%的酵母膏、O. 215% O. 225 %的磷酸氫二鈉、O. 455 % O. 457 %的磷酸氫二鉀、2. 225 2. 226 %的乙醇、O. 18% O. 22%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。
具體實施方式
三本實施方式細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。本實施方式效果最佳。
具體實施方式
四本實施方式細菌纖維素的發酵方法按以下步驟實施一、將保存的細菌纖維素產生菌接種到固體培養基上進行菌種平板活化；
二、種子培養用接種環挑取固體培養基上活化的細菌纖維素產生菌轉接到種子培養基，再放置于溫度為30°C、轉速為150r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24h,種子培養基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成；三、發酵培養按體積7%的接種量將種子培養基接入細菌纖維素高產發酵培養基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養箱中培養7天，即完成細菌纖維素的發酵；步驟三中細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氫二鈉、O. 454% O. 458%的磷酸氫二鉀、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸懼水組成，初始pH值為6. 5。細菌纖維素發酵完成后所生成的細菌纖維素膜浮于液面，膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面培養基及雜質；再將膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測PH值，至pH值約為7. 2后80°C干燥至恒重，進行稱重。采用本實施方式中的發酵培養基打破了細菌纖維素產生菌自身固有的代謝網絡的遺傳特性，改變了代謝產物的積累，從而實現了對細胞代謝途徑的修飾，提高了細菌纖維素。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四的不同點是步驟一中將保存的細菌纖維素產生菌接種到固體培養基上，在30°C的恒溫電熱培養箱中培養18 24h ;固體培養基按重量百分比由3%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的Na2HP04、O. 1%的1(2即04、0. 1%的檸檬酸、0.025%的1%504、2%的瓊脂和余量的水組成。其它步驟及參數與實施方式四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
五的不同點是步驟三中細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O. 19% O. 21%的酵母膏、O. 215% O. 225%的磷酸氫二鈉、O. 455% O. 457%的磷酸氫二鉀、2. 225 2. 226%的乙醇、O. 18% O. 22%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5。其它步驟及參數與實施方式五相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
五的不同點是步驟三中細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始PH值為6. 5。其它步驟及參數與實施方式五相同。
具體實施方式
八本實施方式細菌纖維素的發酵方法按以下步驟實施一、將保存的細菌纖維素產生菌接種到固體培養基上進行菌種平板活化；二、種子培養用接種環挑取固體培養基上活化的細菌纖維素產生菌轉接到種子培養基，再放置于溫度為30°C、轉速為150r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24h,種子培養基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成；三、發酵培養按體積7%的接種量將種子培養基接入細菌纖維素高產發酵培養基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養箱中培養7天，即完成細菌纖維素的發酵；步驟三中細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332% 的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5。細菌纖維素發酵完成后所生成的細菌纖維素膜浮于液面，膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面培養基及雜質；再將膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測PH值，至pH值約為7. 2后80°C干燥至恒重，進行稱重。分別選用基本細菌纖維素發酵培養基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的檸檬酸、O. 025% 的 MgSO4^P余量的蒸餾水組成)，功能驗證細菌纖維素發酵培養基(按重量百分比由3. 9789%的葡萄糖、O. 3396%的牛肉膏、O. 1933%的酵母膏、O. 2230%的磷酸氫二鈉、O. 4565%的磷酸氫二鉀、2. 2255%的乙醇和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5)和本實施方式細菌纖維素高產發酵培養基進行對比發酵試驗和理論研究。采用基本細菌纖維素發酵培養基進行細菌纖維素產生菌的發酵生產，在Acetate節點優化前流量的70. 78%進入TCA循環，并且整個代謝途徑中大多流量進入了無效循環造成碳源浪費；而采用本實施方式細菌纖維素高產發酵培養基有23. 03%的流量進入TCA循環，41. 28%流量進入了乙酸途徑。本實施方式中添加檸檬酸鈉對細菌纖維素產量有重大影響，使之與基本細菌纖維素發酵培養基相比產量顯著增加。檸檬酸鈉可加快丙酮酸向AcCOA的轉變，加速乙酸的消耗，減少胞外乙酸的積累，使得發酵前期進入乙酸副產物生成途徑流量減少，并更早的被利用進入生成細菌纖維素途徑，提高細菌纖維素產量。檸檬酸鈉的加入能使發酵后期甘油加速分解利用，甘油通過FADH2進入呼吸鏈參與能量代謝。實驗證明檸檬酸鈉使發酵的代謝轉變更早發生，檸檬酸鈉不僅能很好的調控代謝流量，使之更多的進入細菌纖維素生成途徑。發酵液及胞內的pH值降低是由發酵液中有機酸的積累造成的，而低pH影響生物合成途徑中關鍵酶，同樣較低的PH也使得細胞活力受到影響，因此，pH過低不僅影響發酵環境，還會增加副產物的產生，限制了 BC的形成。檸檬酸鈉具有很好pH緩沖及調節性能，可為細菌纖維素高產發酵培養基維持較高的pH值；而且檸檬酸鈉能增強PDH活性，增加PYR等有機酸的消耗，能進一步的維持較高PH值，提升BC產量。pH動態平衡依賴于ATP，ATP供給增強可促進該平衡過程，檸檬酸鈉是一種弱酸強堿鹽，具有良好的PH調節和緩沖性能，檸檬酸鈉的添加有利于ATP能量的轉化。此外，檸檬酸鈉可抑制PK酶活，減少了有機酸等代謝副產物的生成；而且能影響PYR節點途徑流量分配，減少副產物生成，提高BC的產量。EMP途徑中，檸檬酸鈉起到主要的調控作用，使丙酮酸激酶酶活大大降低，產生的乙酸和丙酮酸副產物后期進入糖異生途徑被利用合成細菌纖維素；TCA途徑中，發酵初期本實施方式中細菌纖維素產生菌的丙酮酸脫氫酶O3DH)酶活比優化前提高3. 5855倍以上，檸檬酸副產物大大減少；丙酮酸脫氫酶酶活活性被提高，而I3DH作為TCA循環的前體物質乙酰CoA生成的關鍵酶，催化PYR氧化脫羧生成乙酰CoA，同時將NAD+還原為NADH，為生物體供應充足能量；同時乙酰CoA的增加，一方面加速TCA循環，為菌體生長和BC合成提供能量；另一方面，可以激活丙酮酸羧化酶，加速PYR生成草酰乙酸，促進糖異生，合成更多BC。本實施方式細菌纖維素高產發酵培養基中朽1檬酸鈉最大的作用不是在抑制丙酮酸激酶，而是減少代謝流進入代謝副產物和無效循環途徑。從整個發酵過程來看，發酵初期在滿足菌體快速生長的同時，代謝流快速進入能量代謝和代謝副產物生成方向，發酵中期胞外代謝副產物出現明顯的代謝轉變，部分代謝副產物被利用，此時糖異生途徑被強化，產 物合成速率加快?？刂埔宜岷蚑CA循環之間的流量分配，降低乙酸、檸檬酸等代謝副產物的生成，從而提高細菌纖維素產率和糖酸轉化率。乙醇快速氧化轉化為乙酸，產生菌體生長及產物生成所需能量，所以本實施方式發酵初期乙醇主要起到提高能量的調控作用。乙醇的加入可調控碳流通過G6P節點進入BC直接合成途徑，而且乙醇快速產生的高能荷增強PDH活性，致使TCA循環流量減少，減少了檸檬酸的產生和碳源浪費，達到了提高BC產量的目的。并且乙醇的添加活躍HMP途徑，大量代謝流通過HMP途徑進入EMP途徑，增強菌體呼吸代謝能力，使PK酶活大幅升高(而PK酶活過高不利于產物積累)，為初級代謝提供能量；但同時因為本實施方式中檸檬酸鹽與葡萄糖的聯合代謝會增加胞內Ca2+的濃度，從而強烈抑制PK酶的活力，減慢EMP過程，糖異生途徑相應地增強，因此BC產量增加，副產物的生成相應地減少；同時發酵初期HMP途徑生成大量能量滿足了菌體生長及產物合成的需要，此時高活性的PDH催化產生的乙酰CoA激活丙酮酸羧化酶，加速PYR通過草酰乙酸進入糖異生途徑，進行產物合成，此時乙酰CoA進入TCA途徑流量減少，因此本實施方式發酵過程中檸檬酸積累量遠低于采用基本細菌纖維素發酵培養基。采用基本細菌纖維素發酵培養基PK酶活整個發酵過程比較低，這是因為發酵過程HMP途徑較弱，為菌體生長提供的所需能量及中間產物不足造成的。與采用基本細菌纖維素發酵培養基相比，功能驗證細菌纖維素發酵培養基發酵初期HK酶活是前者的2. 71倍，G6PDH為前者2. 43倍，實驗結論與Takaaki等(TakaakiNaritomi, Tohrukouda, Fumihiro Yoshinagaet al. Effect of Ethanol on BacterialCelluose Prodution from Fructosein Continuous Culture. Journal Of FermentationAnd Bioengineering, 95 (1998)，598-603.)添加乙醇抑制G6PDH的結論不同，添加乙醇的發酵培養基在發酵初期G6TOH酶活依舊較高。在本實施方式發酵中后期G6TOH活性受到抑制，說明發酵初期乙醇在通過HMP途徑快速提供菌體生長所需能量及前體物質方面具有重要作用；乙醇調控對HK、G6PDH影響較大。本實施方式發酵過程中乙酸積累下降，是由于添加檸檬酸鈉，PK酶活降低，EMP途徑減弱，需要更多乙醇通過TCA為菌體供能，則乙酸鹽轉化成乙酸的產量減少；同時糖異生途徑的增強也會加速乙酸的利用。本實施方式發酵過程中PYR積累量明顯提高；這種結果與酶活變化并沒有明顯的相關性；是因為檸檬酸鈉降低PK酶活，EMP途徑被抑制，糖異生途徑增強，乙酸、甘油作為底物形成PYR進入糖異生途徑，使得PYR積累量進一步增加。本實施方式細菌纖維素的發酵方法可明顯提高BC產量。
具體實施方式
五本實施方式細菌纖維素的發酵方法按以下步驟實施一、將保存的漢氏葡糖醋桿菌DHM1-3接種到固體培養基上進行菌種平板活化；二、種子培養用接種環挑取固體培養基上活化的漢氏葡糖醋桿菌DHM1-3轉接到種子培養基，再放置于溫度為30°C、轉速為150r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24h,種子培養基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成； 三、發酵培養按體積7%的接種量將種子培養基接入細菌纖維素高產發酵培養基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養箱中培養7天，即完成細菌纖維素的發酵；步驟三中細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5。細菌纖維素發酵完成后所生成的細菌纖維素膜浮于液面，膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面培養基及雜質；再將膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測PH值，至pH值約為7. 2后80°C干燥至恒重，進行稱重。采用基本細菌纖維素發酵培養基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的檸檬酸、O. 025% 的 MgSO4 和余量的蒸餾水組成)進行對比發酵試驗。以基本細菌纖維素發酵培養基的發酵方法為優化前，以本實施方式細菌纖維素的發酵方法為優化后，根據分析和實驗得出漢氏葡糖醋桿菌DHM1-3優化前后細菌纖維素發酵代謝流分布(如圖I所示，由于PFK缺乏或者活性很低，在構建網絡時忽略了 F6P — G3P的反應。HPM途徑和TCA循環中異檸檬酸脫氫酶反應是NADPH的主要合成途徑。產生的NADPH主要用于生物合成。由于HMP代謝葡萄糖產生NADPH，然后進入TCA循環，這個過程中并沒有代謝分支；HMP代謝網絡簡化為G6P — RU5P — 2/3F6P+1/3G3P)。圖I中以葡萄糖的摩爾消耗速率為100計，得到各產物生成速率對應葡萄糖消耗速率的比值。將這些速率代入矩陣，通過MATLAB利用最小二乘法計算得到優化前后代謝流分布。HMP途徑中G6P到RU5P的反應是不可逆反應，TCA循環中a-酮戊二酸脫氫酶和檸檬酸合成酶催化的反應也是不可逆的，由此得到的代謝通量分布圖中并沒有出現負值，因此計算得到的代謝流量沒有違背生化熱力學條件，說明構建的代謝網絡較為合理。由圖I可以看出，葡萄糖主要經過HM、TCA途徑進行能量代謝，并為菌體生成提供核酸、蛋白質、脂肪、小分子中間代謝產物等。剩余的代謝流量進入細菌纖維素合成途徑或者代謝流溢流進入無效循環。對比優化前后代謝通量分布發現，菌體生長通量相差不大；HMP途徑代謝流量由優化前的90. 77降為74. 9 ;優化后碳流量在流向生成大量菌體的同時，有22. 8%的流量進入細菌纖維素合成途徑，優化前的細菌纖維素合成流量只占6. 68%。對比優化前后菌體生物量及產物產量，可知細菌纖維素的合成與菌體的生長密切相關，但菌體的大量生長并不是細菌纖維素產量提高的直接原因。碳代謝流量先充分滿足菌體合成后，才轉入次生代謝產物的合成和代謝副產物的生成。優化前后代謝通量分布另一個區別就是優化前乙酸通量為0，而優化后乙酸通量高達41. 28%。這也可能是影響優化后培養基細菌纖維素產量繼續提高的一個原因。因為乙醇的添加和快速氧化，在快速提高能量增加細菌纖維素產量的同時，也增加了乙酸的產生，從而惡化發酵液環境，影響菌體和細菌纖維素產量繼續增加，使流量更多的進入無效循環。而優化前乙酸為0，細菌纖維素產量很低，可能的原因是HMP和TCA產生的能量僅用于菌體生成，而細菌纖維素合成途徑可能受到阻礙或者反饋調節沒被解除，或者是生成的乙酸，在能量不足的情況下直接被氧化利用，使之無法積累。優化前進入HMP的流量是90. 77，細胞多糖合成是2. 55，細菌纖維素合成是6. 68。這個過程所需能量主要是通過HMP代謝葡萄糖和TCA循環得到。細菌纖維素產量過低可能是在HMP和TCA循環過程中產生較多的無效循環所致。
優化后進入HMP的流量是74. 9，細胞多糖合成是2. 3，細菌纖維素合成是22. 8。與優化前通量相比，后者代謝流量發生了較大改變。優化后^(22.8)/^5(74.9) = 0.304，而優化前r2 (6. 68) /r5 (90. 77) = O. 07。也就是說優化后碳代謝流更多流向細菌纖維素合成方向，從而使其產量比優化前有了大幅提高。造成這種情況的原因，是乙醇和檸檬酸鈉的添力口，能快速氧化進入TCA循環用于能量生成；另外由于乙醇的快速氧化產生高能荷的ATP，而高能荷的ATP是HMP途徑中關鍵酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制劑，從而在滿足菌體生長所需能量的條件下，使代謝流量更多的進入細菌纖維素合成方向。對于Acetate節點，流入F6P和PYR的流量都是來自于HMP,通過Acetate進入乙酸和AcCOA0 F6P生成Acetate涉及一系列生化反應，它是替代EMP途徑使代謝流進入TCA循環，這與HMP中間產物有關。優化前后的最大差別就是，優化前來自于HPM流量的81. 2進入了 AcCOA，而優化后41. 28的流量進入了乙酸途徑，僅有30. 17的流量進入AcCOA。從整個途徑來看，優化前沒有乙酸產生可能是某些代謝途徑障礙所致。而優化后產生大量乙酸是乙醇快速氧化的結果，并不是細菌纖維素產量提高的原因。在細菌纖維素合成過程中，除乙酸外，葡萄糖酸的產生也使pH快速下降。另外，發酵后期由于菌體進入衰亡期，纖維素的生物合成變慢，出現代謝溢流，使代謝流發生遷移，更多的流量進入代謝副產物生產途徑。這些副產物的形成可能與條件控制直接相關。因此基于代謝流分析，可以看出本實施方式從遺傳角度和發酵控制方面使副產物的生成減少，就能達到代謝流遷移的目的，從而增大細菌纖維素生物合成途徑的流量?；炯毦w維素發酵培養基發酵過程曲線圖如圖2所示，本實施方式使用本發明細菌纖維素高產發酵培養基發酵細菌纖維素的過程曲線圖如圖3所示。測得基本細菌纖維素發酵培養基每升細菌纖維素高產發酵培養基中所獲得的細菌纖維素膜膜干重為I. 232g/L，產量一直增加不明顯，本實施方式每升細菌纖維素高產發酵培養基中細菌纖維素產量增加很快，跟菌體生長趨勢相似，所獲得的細菌纖維素膜膜干重為3. 362g/L，增重克數為2. 13g/L，細菌纖維素增產173%。在底物消耗方面，兩種培養基發酵過程基本相似，都在第一天都有一個快速消耗，這與漢氏葡糖醋桿菌獨特的代謝途徑相關，有部分葡萄糖轉化為葡萄糖酸，這也是致使發酵液pH值降低很快，影響細菌纖維素產量的一個重要原因。此后兩天耗糖不高，基本細菌纖維素發酵培養基在第三天進入快速耗糖期，直至發酵終止耗糖并沒減慢，與菌體生長相適應，可能相當一部分消耗的糖都進入菌體生長途徑。本實施方式在第四天進入快速耗糖期，到最后一天有個小幅減慢過程。兩者殘糖分別為26. 5g/L和18. 5g/L，但兩者的糖利用率都不高，分別為41%和47% ;而本實施方式與基本細菌纖維素發酵培養基最大的不同就是添加了乙醇，乙醇從發酵開始就快速消耗，直至第四天耗盡，葡萄糖才開始進入快速消耗期。乙醇在發酵開始就快速氧化，為菌體生長代謝和產物生成提供足夠的能量，從而使更多的碳代謝流量進入產物合成途徑。這也解釋了耗糖量相差不大，本實施方式產量卻是基本細菌纖維素發酵培養基的2. 73倍的情況。基本細菌纖維素發酵培養基中可能因為乙酸代謝途徑或者別的代謝途徑出現障礙，代謝中間產物出現積累，影響了碳代謝流通過糖異生非直接途徑合成細菌纖維素。本實施方式發酵過程中乙酸有了一定積累，但后期乙酸量減少，原因可能是因為發酵前期乙醇快速氧化產生的能量被利用，而乙醇被氧化轉化成乙酸，后期能量不夠乙酸作為底物又被重新利用?；炯毦w維素發酵培養基中代謝流發生了遷移，大量進入了無效循環，造成碳 源浪費。本實施方式使得產物產量有了明顯提高更適合菌體生長和發酵生產細菌纖維素。
具體實施方式
六本實施方式細菌纖維素的發酵方法按以下步驟實施一、將保存的醋化醋桿菌接種到固體培養基上進行菌種平板活化；二、種子培養用接種環挑取固體培養基上活化的醋化醋桿菌轉接到種子培養基，再放置于溫度為30°C、轉速為150r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24h,種子培養基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成；三、發酵培養按體積7%的接種量將種子培養基接入細菌纖維素高產發酵培養基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養箱中培養7天，即完成細菌纖維素的發酵；步驟三中細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5。細菌纖維素發酵完成后所生成的細菌纖維素膜浮于液面，膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面培養基及雜質；再將膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測PH值，至pH值約為7. 2后80°C干燥至恒重，進行稱重。采用基本細菌纖維素發酵培養基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的檸檬酸、O. 025% 的 MgSO4 和余量的蒸餾水組成)進行對比發酵試驗。測得基本細菌纖維素發酵培養基每升細菌纖維素高產發酵培養基中所獲得的細菌纖維素膜膜干重為O. 57g/L，本實施方式每升細菌纖維素高產發酵培養基中所獲得的細菌纖維素膜膜干重為I. 04g/L，增重克數為O. 47g/L，細菌纖維素增產82. 46%。
具體實施方式
八本實施方式細菌纖維素的發酵方法按以下步驟實施一、將保存的Gluconacetobacter europaeus接種到固體培養基上進行菌種平板活化；二、種子培養用接種環挑取固體培養基上活化的Gluconacetobacter europaeus轉接到種子培養基，再放置于溫度為30°C、轉速為150r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24h，種子培養基按重量百分比由2 %的蔗糖、O. 3 %的酵母膏、O. 5 %的蛋白胨、O. 2 %的ΚΗ2Ρ04、O. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成；三、發酵培養按體積7%的接種量將種子培養基接入細菌纖維素高產發酵培養基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養箱中培養7天，即完成細菌纖維素的發酵；步驟三中細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5。細菌纖維素發酵完成后所生成的細菌纖維素膜浮于液面，膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面培養基及雜質；再將膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去 除液膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測PH值，至pH值約為7. 2后80°C干燥至恒重，進行稱重。采用基本細菌纖維素發酵培養基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的檸檬酸、O. 025% 的 MgSO4 和余量的蒸餾水組成)進行對比發酵試驗。測得基本細菌纖維素發酵培養基每升細菌纖維素高產發酵培養基中所獲得的細菌纖維素膜膜干重為O. 89g/L，本實施方式每升細菌纖維素高產發酵培養基中所獲得的細菌纖維素膜膜干重為I. 87g/L，增重克數為O. 98g/L，細菌纖維素增產110. 11%。
權利要求
1.細菌纖維素高產發酵培養基，其特征在于細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O.21% O. 23%的磷酸氫二鈉、O. 454% O. 458%的磷酸氫二鉀、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。
2.根據權利要求I所述的細菌纖維素高產發酵培養基，其特征在于細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O. 19% O.21 %的酵母膏、O. 215 % O. 225 %的磷酸氫二鈉、O. 455 % O. 457 %的磷酸氫二鉀、2.225 2. 226%的乙醇、O. 18% O. 22%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。
3.根據權利要求I所述的細菌纖維素高產發酵培養基，其特征在于細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2 %的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。
4.采用權利要求I所述細菌纖維素高產發酵培養基的細菌纖維素發酵方法，其特征在于細菌纖維素的發酵方法按以下步驟實施 一、將保存的細菌纖維素產生菌接種到固體培養基上進行菌種平板活化； 二、種子培養用接種環挑取固體培養基上活化的細菌纖維素產生菌轉接到種子培養基，再放置于溫度為30°C、轉速為150r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24h,種子培養基按重量百分比由2%的蔗糖、0.3%的酵母膏、0.5%的蛋白胨、0.2%的KH2PO4、O. 015 %的MgSO4和余量蒸餾水制成； 三、發酵培養按體積7%的接種量將種子培養基接入細菌纖維素高產發酵培養基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養箱中培養7天，即完成細菌纖維素的發酵； 步驟三中細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O.30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氫二鈉、O.454% O. 458%的磷酸氫二鉀、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸懼水組成，初始pH值為6. 5。
5.根據權利要求4所述的細菌纖維素的發酵方法，其特征在于步驟一中將保存的細菌纖維素產生菌接種到固體培養基上，在30°C的恒溫電熱培養箱中培養18 24h ;固體培養基按重量百分比由3%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的Na2HP04、0. 1%的Κ2ΗΡ04、0. I %的檸檬酸、O. 025%的MgS04、2%的瓊脂和余量的水組成。
6.根據權利要求5所述的細菌纖維素的發酵方法，其特征在于步驟三中細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O.19% O. 21%的酵母膏、O. 215% O. 225%的磷酸氫二鈉、O. 455% O. 457%的磷酸氫二鉀、2. 225 2. 226%的乙醇、O. 18% O. 22%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6.5。
7.根據權利要求5所述的細菌纖維素的發酵方法，其特征在于步驟三中細菌纖維素高產發酵培養基按重量百分比由3. 92 %的葡萄糖、O. 332 %的牛肉膏、O. 191 %的酵母膏、O.218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始PH值為6. 5。
全文摘要
細菌纖維素高產發酵培養基及細菌纖維素的發酵方法，涉及一種細菌纖維素發酵培養基及細菌纖維素的發酵方法。它解決了目前細菌纖維素產量低的問題。培養基由葡萄糖、牛肉膏、酵母膏、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、乙醇、檸檬酸鈉和蒸餾水組成。發酵方法一、菌種活化；二、種子培養；三、發酵培養。采用本發明技術細菌纖維素產量大幅提升，增加量均超過80％。本發明可用于細菌纖維素生產領域。
文檔編號C12R1/01GK102827897SQ20121036208
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者雷虹, 李元敬, 張基亮, 陳雪梅, 田華, 平文祥, 韓德權 申請人:黑龍江大學