專利名稱：低密度脂蛋白膽固醇定量法的制作方法
技術領域：
本發明涉及對低密度脂蛋白膽固醇的改良的測定方法及相關試劑盒。
背景技術：
血漿中膽固醇的存在和運輸形式為血漿脂蛋白，即血漿中非極性的脂類包括膽固醇和親水性的載脂蛋白結合，使得脂蛋白有較強的水溶性可以在血中運輸。血漿脂蛋白可以分為高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜顆粒四種，其中低密度脂蛋白主要負責將膽固醇運輸至外周組織，而高密度脂蛋白是清除動脈壁上的膽固醇向肝臟運輸。流行病學和臨床研究表明，低密度脂蛋白膽固醇水平與動脈硬化類疾病冠心病的發生率成正相關，高密度脂蛋白膽固醇與動脈硬化類疾病冠心病的發生率成負相關，即具有抗動脈硬化活性。因此高密度脂蛋白膽固醇HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C是當前臨床實驗室血脂測定中最有價值的心腦血管疾病的危險因素指標。

測定高低密度脂蛋白膽固醇的方法很多，包括超離心法、色譜法、電泳法和沉淀法等。超離心法可作為基本的定量法使用，它使用超速離心機進行分離，根據比重的差別分離LDL或HDL，進而測定其中的膽固醇含量；而后來發展的電泳法以醋酸纖維膜或瓊脂糖凝膠等做載體分離，然后根據酶法測定膽固醇含量；在沉淀法中，沉淀劑凝結除高密度脂蛋白以外的脂蛋白，凝結的脂蛋白通過離心分離沉淀，根據酶反應測定上清即高密度脂蛋白膽固醇的含量；測定低密度脂蛋白膽固醇的第一代化學沉淀法，采用PVS和PEGME沉淀LDL，用離心分離法收集沉淀物，然后根據酶反應測定其中的膽固醇含量；以上方法均需要特殊儀器，包括超速離心機、電泳儀和離心機等，操作復雜，難于自動化，從而無法在臨床實驗室開展。

發明內容
本方法所涉及的直接定量低密度脂蛋白膽固醇的方法，采用優化的PVS沉淀法，僅包裹LDL使其無法參與酶反應，但不會沉淀LDL即形成不溶物，然后LDL中的膽固醇成分在第一和第二表面活性劑的聯合作用下直接測量；詳細而言，即高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒中的膽固醇在對低密度脂蛋白以外的脂蛋白膽固醇反應性較好的第一表面活性劑的作用下參與膽固醇脂酶反應，低密度脂蛋白膽固醇在第二表面活性劑的作用下溶解釋放以進行酶反應法測定其膽固醇含量。酶反應中第一步產生的過氧化氫不必使用過氧化物酶去除，所以在第二步中不必加入抑制過氧化物酶活性的疊氮鈉。本發明中可以使用生物防腐劑。本發明的方法中無需標本前處理即沉淀和離心，可以直接在自動生化儀測定標本中的低密度脂蛋白膽固醇。本發明所用的優化的聚乙烯硫酸三鉀PVS化學沉淀法即優化濃度和比例的PVS和PEGME，在檢測低密度脂蛋白膽固醇時，采用優化濃度和比例的PVS和PEGME包裹LDL，優化后的比例為1:400-500，濃度分別為l-20mg / L和4g_10g / L ;同時為了避免VLDL的共同被包裹，采用能掩蔽二價陽離子的金屬螯合劑包括EDTA或EGTA等，其使用濃度為
O.lmM-2mM ;其他只要是和低密度脂蛋白親和性較強的化合物，可以是促使其凝聚的聚陰離子、肝素鈉、磷鎢酸、環糊精硫酸鹽等，或對其有較強親和力又不導致沉淀產生的皂苷類化合物也可以使用，它們可以單獨使用或兩種或以上組合使用，這些物質的使用量不受特別限制，根據物質種類及組合方式而不同，盡量選用凝結或混濁少的組合；同時為了生化儀的維護要求，盡量不使用或使用低濃度的鎂離子。對于第一表面活性劑的選用，可以是離子或非離子的選擇性表面活性劑，可以是對高密度脂蛋白有較好反應性的表面活性劑或對低密度脂蛋白以外的脂蛋白有較好反應性的表面活性劑，如聚氧乙烯類衍生物或聚氧乙烯-聚氧丙烯的縮合物，包括聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基三苯基醚或聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽等。對于第二表面活性劑的選用，其是可以與所有脂蛋白反應或至少可以與低密度脂蛋白反應的表面活性劑，如 L121,或 Triton X100、Tween 20、lipomin LA、Anhitol 24B 和膽酸等。作為這些表面活性劑的商業上可得到的產品實例，包括Emulgen系列如Emulgen108、Emulgen220、Emulgen 913、Emulgen709、Emulgen B66、Emulgen A60 (或 A6 系列)、Emulgen A90 (或 A9 系列)、Emulgen 911、Emulgen L-40 等，和 pluronic 系列如 PluronicF88> PluronicF68> Pluronic L121、Pluronic L123、Pluronic L101> Pluronic L108 等和Triton XlOO等。這些表面活性劑可以單獨使用或者兩種或以上組合使用。這些表面活性劑的用量沒有特別限制，一般來說，表面活性劑的濃度優選為O. 01% — 3% w / V之間。特別優選的濃度為O. 05%-l%w / V。膽固醇反應應用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶進行，生成的過氧化氫在過氧化物酶作用下用4-氨基安替比林和高敏感度色原進行吸光度分析測定，并計算出低密度脂蛋白膽固醇的含量。作為商業上可得到的色原包括日本同仁化學的N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-間苯甲胺(T00S )、N- (2-羥基-3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺(HDAOS )、N-乙基-N- (3-甲基苯基)-N’ -琥珀酰基乙二胺(EMSE)等。作為這些色原的濃度，優選
O.1mM-lOmM。用于低密度脂蛋白膽固醇定量的試劑，除含有以上所屬化合物、表面活性劑、酶及色原等外，其所采用的緩沖液為Goods緩沖液，例如有HEPES、MES、MOPS和PIPES等。緩沖液的PH為5-10，優選為6-8。緩沖液的濃度為5-200mM，優選為20mM-100mM。


圖1顯示采用本發明的檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒I檢測結果與對照試劑的檢測結果具有相關性；圖2顯示采用本發明的檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒2檢測結果與對照試劑的檢測結果具有相關性。
具體實施方式
實施例1用于檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒I的成分和使用方法1.試劑成分本申請的檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒I包括兩種成分，分別是試劑I
MOPS (pH7.0)20mM
PVS20rng/L
PEGME8g/L
EDTA2 mM
4AA0.5g/L
膽固醇酯酶5KU/L
膽固醇氧化酶10KU/L
Emulgen A6 糸列O.1 %w/v
PC3000.5g/L試劑2
MOPS (pH7.0)20mM
過氧化物酶30KU/L
HDAOS2mM
Triton X IOOlg/L
PC3000.5g/L2.試劑盒I的使用方法使用Olympus AU400自動分析儀分別進行測定,實驗操作如下血清3口 I,第一試劑225 μ 1，37°C反應5分鐘，第二試劑75 μ I反應5分鐘，測定主波長600nm，副波長700nm，用吸光度差進行計算。對照試劑按照其說明書所述參數進行實驗。方法對比中，本試劑和對比試劑(日本協和Kyowa Medex Co.,下同)分別用各自的校準血清進行定標。同時測定了 40例臨床標本LDL-C含量，結果如表1、圖1所示。結果顯示出檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒I按本發明方法獲的結果與對照試劑獲得的結果有良好的相關性。表I
權利要求
1.一種測定樣品中低密度脂蛋白膽固醇的含量的方法，其步驟為 1)用優化比例和濃度的聚乙烯硫酸三鉀和聚乙二醇獨甲醚與所述的樣品接觸，所述的聚乙烯硫酸三鉀和聚乙二醇獨甲醚的優化比例為1:400-500，所述的優化濃度分別為10-20mg / L 和 4g-10g / L ； 2)在不形成沉淀的條件下聯合至少一種表面活性劑通過酶法測定所述樣品中低密度脂蛋白膽固醇的含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的至少一種表面活性劑為第一表面活性劑和第二表面活性劑的組合，所述第一表面活性劑選自聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基三苯基醚或聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽；所述第二表面活性劑選自 Triton X100、聚氧乙烯-聚氧丙烯的縮合物Pluronic L121、Pluronic L123、PluronicL101> Pluronic L108、PluronicF68、Tween 20、lipomin LA、Anhitol 24B 或膽酸。
3.根據權利要求2所述的方法,進一步加入O.lmM-2mM的能掩蔽二價陽離子的金屬螯合劑。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述的金屬螯合劑為EDTA或EGTA。
5.根據權利要求2所述的方法，酶反應所產生的過氧化氫無需過氧化物酶或過氧化氫酶去除，從而不需要加入疊氮鈉。
6.根據權利要求2所述的方法，其中所述的第二表面活性劑與脂蛋白反應或至少與低密度脂蛋白反應。
7.用于檢測低密度脂蛋白膽固醇含量的試劑盒，其包括試劑I和試劑2，其中 -試劑I包括10_20mg / L聚乙烯硫酸三鉀、4-10g / L聚乙二醇獨甲醚、O. l_5mM EDTA,1-10KU / L膽固醇酯酶、5-20KU / L膽固醇氧化酶、O. l-l%w / v的至少一種選自聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基三苯基醚或聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽的第一表面活性劑； -試劑2包括10-30KU / L過氧化物酶、O. l-l%w / v的至少一種選自Triton X100、聚氧乙烯-聚氧丙烯的縮合物 Pluronic L121、PluronicL123> Pluronic L101> PluronicL108、Pluronic F68> Tween 20、lipominLA、Anhitol 24B 或膽酸的第二表面活性劑；和 _說明書。
全文摘要
本發明公開一種低密度脂蛋白膽固醇定量法，采用優化濃度和比例的聚乙烯硫酸三鉀(polyvinylsulphate K-salt，PVS)和聚乙二醇獨甲醚(Methoxypolyethylene glycol，PEGME)，即優化的化學沉淀法，聯合對低密度脂蛋白膽固醇反應性較好的表面活性劑進行特異性的低密度脂蛋白膽固醇的含量測定。
文檔編號C12Q1/44GK103060426SQ20121036227
公開日2013年4月24日 申請日期2009年3月6日 優先權日2008年4月1日
發明者孫國敬 申請人:北京九強生物技術股份有限公司